甲狀腺素對HepG2細胞氧化損傷的保護作用

陳立立 ， 唐 雪 ，2， 徐圓媛 ， 余 靜 ， 樂國偉 ，2， 施用暉 *，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122）

氧化應激是指機體氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。過多自由基會作用于生物大分子，破壞細胞、組織結構，是導致動脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、衰老、癌癥等的發生發展的重要因素[1]。有研究表明，糖尿病患者體內自由基活性增強，各種抗氧化酶如SOD、CAT等活力都降低，GSH、VC、VE等具有抗氧化能力的物質水平也會降低[2]。T3是機體內甲狀腺激素的主要生物活性形式[3]。既往臨床工作中發現，許多2型糖尿病患者血清FT3水平較正常組顯著下降，且隨著病齡的延長T3水平降低越顯著[4]。肝硬化患者體內血清T3水平與血清MDA水平呈負相關，與GSH和GSHPx水平呈正相關[5]。張洪梅等[6]研究表明，隨著甲狀腺激素缺乏時間的延長，大鼠腦組織氧化應激狀態會發生改變，抗氧化損傷能力不足以代償活性氧造成的損傷，最后出現腦損傷。另有研究表明，T3預處理可逆轉肝臟缺血再灌注損傷引起的GSH、MDA改變，有效保護小鼠肝臟缺血再灌注損傷[7]。且有研究表明，T3可作為促進胰島β細胞存活和抗其凋亡的保護因子[8]。因此，推測T3可能具有抗氧化保護功能。

核轉錄相關因子（Nrf2）是重要的轉錄因子，在氧化應激等情況下與Kelch樣ECH聯合蛋白質1（Keap1）解離，進入胞質啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因（如NQO1、HO-1）的表達，增加細胞對氧化應激和親電子化學物質的抗性[9]。已有研究表明，T3處理大鼠可導致N-乙酰半胱氨酸預處理的肝臟Nrf2活性的提高[10]。PI3K是Nrf2的上游調節因子，抑制PI3K會阻斷Nrf2的核易位及誘導應激蛋白質表達，因此在維持細胞氧化還原狀態方面也起到重要作用[11]。

過氧化氫是一種重要的活性氧，其易于獲得，性質相對穩定，所以它已成為研究細胞氧化損傷的重要工具[12]。作者以人肝癌細胞（HepG2）為基礎，以過氧化氫為氧化應激誘導劑，構建體外氧化應激細胞模型，加入不同濃度的T3處理，從細胞自由基水平、存活率、多種抗氧化酶活及 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1等基因表達水平等多角度，全面分析T3的抗氧化作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細胞，購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 試劑及儀器

DMEM基礎培養基，購自Gibco公司；T3，購自Sigma 公司；胰蛋白酶（Trypsin），購自 Amresco 公司；新生小牛血清，購自中國杭州四季青生物技術有限公司；活性氧檢測試劑盒、細胞裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、Trizol、RT-PCR相關試劑，均購自碧云天生物技術研究所；T-AOC測試盒、SOD測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

多功能酶標儀，Biotek公司制造；CO2細胞培養箱，Thermo公司制造；還有日立7000型熒光分光光度計，Olympus倒置顯微鏡等。

實驗中部分引物用Primerpremier5.0軟件設計，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 細胞培養

將HepG2細胞按5×105個/mL接種在含體積分數10%滅活新生小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中（pH 7.2），37℃、質量分數5%CO2的細胞培養箱中培養。細胞為多角形貼壁生長，每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 H2O2誘導HepG2細胞損傷模型的建立

1.4.1 實驗分組及藥物處理 實驗分組：正常對照組，加入常規培養液；H2O2處理2 h組，加入培養液和 H2O2，H2O2終濃度分別為 10、50、100、200 μmol/L；H2O2處理4 h組，加入培養液和H2O2，H2O2終濃度分別為 10、50、100、200 μmol/L。

1.4.2 噻唑藍（MTT）法檢測細胞存活率 取對數生長期HepG2細胞以105個/mL密度接種于96孔板上，每組6孔，于37℃、質量分數5%CO2培養箱中培養，待細胞長至80%左右，去除培養液，加藥物處理，每孔100 μL，處理結束后棄上清液，每孔加入100 μL 培養基和 20 μL 5 g/L 的 MTT，溫育 4 h，去除培養液及MTT，每孔加入200 μL二甲基亞砜，用酶標儀測定各孔在波長570 nm處的吸光度。

1.4.3 ROS探針法檢測細胞自由基水平 取對數生長期HepG2細胞以105個/mL密度接種于96孔的透明底黑板，待細胞增長80%左右，加探針DCFH-DA（事先用無血清的培養基以體積比1∶1 000 稀釋）100 μL，30 min 后棄去孔內液體，用PBS洗兩遍，加H2O2，處理完后用熒光酶標儀檢測，激發波長488 nm，發射波長525 nm，檢測細胞平均熒光強度。

1.5 檢測T3對H2O2誘導的HepG2細胞ROS及存活率的影響

實驗分組：正常對照組；高中低濃度H2O2處理組；H2O2+T3 組 （T3 濃度為 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，用無血清培養基配制）；陽性對照H2O2+硫辛酸LA組（LA濃度為100 μmol/L）。取對數生長期HepG2細胞以104個/mL密度接種于96孔板，24 h后加T3孵育，24 h后棄上清液，加H2O2處理，檢測細胞存活率及ROS水平。

1.6 檢測T3對H2O2誘導的HepG2細胞抗氧化物/酶的影響

實驗分組：正常對照組，100 μmol/L H2O2處理組，H2O2+高中低T3組，H2O2+LA組。取對數生長期HepG2細胞以 3×105個/mL密度接種于 6孔板，24 h后加T3孵育，48 h后棄上清液，加H2O2處理。處理完后每孔加入300 μL細胞裂解液收集。3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，進行BCA蛋白質測定，然后按試劑盒說明書進行T-AOC、GSHPx、SOD、MDA 的測定。

1.7 RT-PCR法檢測目的基因的表達

以1.6方法處理細胞，處理完后每孔加入1 mL Trizol，用氯仿/異丙醇/乙醇法提取細胞內總RNA，并用微量核酸檢測儀測定所提取RNA的濃度及純度。RT-PCR擴增目的片段，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列為：內參β-actin上游引物 5'-TCCCTCAAGATTCTCAGCA-3'，下游引物 5'-ACATCCACAACGCATACA-3'；Nrf2 上游引物 5'-GATGGGTTGGACTGGTGGTGGTT-3'，下游引物 5'-CTCTCGGAGCGGGCGTAGTTTCT-3'；PI3K 上 游 引物5'-TGTACTGGGCCTCATGCACCT-3'，下游引物5'-GGCAAAGCGGCAGTAGTAGAGTAG-3'；NQO1上游引物 5'-GTGGTGGAGTCGGACCTCTATG-3'，下游引物 5'-AAGCCAGAACAGACTCGGCAG-3'；HO-1上游引物5'-ATGACACCAAGGACCAGAG-3'，下游引物 5'-TAAGGACCCATCGGAGAAG-3'。按以下條件進行PCR擴增反應：95℃作用5 min；95℃反應20 s，62℃反應 30 s，72℃反應 20 s；72℃作用2 min。其中第2步到第4步（變性、退火、延伸）設置40個循環。

1.8 數據統計

實驗數據經Excel初步處理后，用SPSS 16.0統計軟件進行單因子方差分析和鄧肯氏多重比較，分析各組間的差異顯著性。顯著水平為p＜0.05，極顯著水平為p＜0.01。數據用垂直條形圖和mean±S.D.形式表示。

2 結果分析

2.1 H2O2對HepG2細胞ROS及存活率的影響

10、50、100、200 μmol/L 的 H2O2處理 HepG2 細胞2、4 h后檢測細胞存活率及ROS（圖1）。

圖1 H2O2對HepG2細胞ROS及存活率的影響Fig.1 Effects of H2O2on ROS and cell viability in HepG2

由圖1可以觀察到，隨著H2O2濃度的提高及作用時間的延長，細胞存活率逐漸下降，ROS水平逐漸提高。100μmol/L的H2O2處理HepG2細胞4 h后，細胞存活率為80%左右，ROS提高至300%左右，與正常細胞差異顯著 （P＜0.05），提示此濃度可建立HepG2細胞體外氧化應激模型。這與韓飛、Farombi等的實驗結果一致[12-13]。

2.2 T3對H2O2誘導的HepG2細胞ROS及存活率的影響

HepG2細胞貼壁生長24 h后，加入不同濃度的T3繼續培養48 h后再用H2O2處理，測定細胞存活率及ROS。如圖2所示，不同濃度的T3對細胞存活率及 ROS 產生了不同影響。10-9、10-7、10-5mol/L 的T3 可分別顯著提高 50、100、200 μmol/L H2O2氧化損傷的細胞的存活率，降低細胞 ROS（P＜0.05），但10-5mol/L的T3反而降低50 μmol/L H2O2氧化損傷的細胞的存活率，增加細胞ROS。最佳作用劑量的T3效果與100 μmol/L LA效果相當。

圖2 T3對H2O2誘導的HepG2細胞ROS及存活率的影響Fig.2 Effects of T3 on ROS and cell viability of H2O2 reduced HepG2 cells

2.3 T3對H2O2誘導的HepG2細胞抗氧化酶的影響

見表1。與對照組相比，100 μmol/L H2O2組細胞內T-AOC、SOD及GSH-Px活性均顯著降低，MDA 含量顯著提高 （P＜0.05）。 加入 10-5、10-7、10-9mol/L的T3可不同程度地提高細胞T-AOC、SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量。其中10-7mol/L T3處理組與H2O2組細胞差異最顯著（P＜0.01）。 結果表明，T3對氧化損傷的HepG2細胞的氧化還原狀態起到了明顯的改善作用，且T3作用效果與使用劑量相關。

2.4 T3對H2O2誘導的HepG2細胞抗氧化相關基因的影響

見表2。與對照組相比，100 μmol/L H2O2組細胞內 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表達均顯著降低，加入T3可不同程度地提高細胞這些基因的表達。其中10-7mol/L T3對PI3K、Nrf2、NQO1的表達提高作用最顯著 （P＜0.01），10-9mol/L T3 對 HO-1 的表達提高作用最顯著（P＜0.01）。結果表明，T3對氧化損傷的HepG2細胞的抗氧化關鍵基因的表達有影響，且與劑量有關。

表1 T3對H2O2誘導的HepG2細胞 T-AOC、SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響（x±s，n=3）Table 1 Effect of T3 on T-AOC，SOD，GSH-Px activities and MDA content in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

表2 T3 對 H2O2誘導的 HepG2 細胞 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表達的影響（x±s，n=3）Table 2 Effect of T3 on the expression of PI3K，Nrf2，NQO1 and HO-1 in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

3 討論

氧化應激是體內氧化和抗氧化水平失去平衡的后果，過量的活性氧會引起分子、細胞和機體的損傷[14]。大量研究表明[15]，氧化應激是代謝綜合征發生和發展的重要病因之一。甲狀腺激素參與機體的正常代謝，與組織器官的氧化和抗氧化狀態有著重要關系。

通過體外建立HepG2細胞H2O2氧化損傷模型，初步研究了T3對氧化損傷細胞存活率、ROS水平、抗氧化酶活性及相關基因表達的影響。結果顯示，10、50、100、200 μmol/L H2O2可顯著提高胞內ROS水平，降低細胞存活率，表明HepG2細胞的ROS水平和存活率與H2O2作用濃度存在劑量效應。為了更好地探究T3作用劑量與細胞損傷程度之間的關系，選擇低中高3個H2O2濃度。比較發現，對 50、100、200 μmol/L H2O2處理的 HepG2 細胞，T3抗氧化保護作用存在差異。 10-9、10-7、10-5mol/L T3可分別顯著降低 50、100、200 μmol/L H2O2處理的細胞的 ROS水平，增加細胞存活率（p＜0.05），表明T3最佳作用劑量與細胞氧化損傷程度有關。有研究表明，補充外源性甲狀腺激素對外科重癥時的器官有保護作用，這已在心、肺、器官移植中得到初步證實[16]。雖然甲狀腺激素的器官保護作用的機制尚不清楚，但已有研究顯示可能與甲狀腺激素可以抑制細胞凋亡等有關[17]。因此，T3對H2O2氧化損傷的HepG2細胞有保護作用可能與T3能抑制HepG2細胞凋亡和清除ROS有關。近年來越來越多證據表明，VA、VC、VE、異黃酮、硫辛酸等被用作抗氧化的物質，在低劑量使用條件下表現抗氧化作用，而在高劑量作用下卻表現促氧化作用[18]。本實驗結果中也有類似發現，10-5mol/L T3反而增加 50 μmol/L H2O2處理的細胞的ROS水平，降低細胞存活率，說明在低程度損傷時，細胞有自行調節氧化還原狀態的能力，而高濃度T3會通過增加細胞代謝而產生更多自由基，從而損害細胞；而隨著損傷加重，T3逐漸顯現抗氧化作用，且損傷程度越嚴重，T3所需濃度越大。

為了進一步探究T3抗氧化保護作用的可能機制，作者檢測了胞內T-AOC、GSH-Px及SOD活性和MDA含量及一些抗氧化相關基因表達。結果顯示，與對照組相比，100 μmol/L H2O2組細胞內TAOC、GSH-Px及SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（p＜0.05），說明細胞內氧化還原平衡被打破，造成細胞內氧化應激。加入T3可顯著降低細胞MDA含量，提高T-AOC、GSH-Px及SOD活性，其中10-7mol/L T3作用效果最顯著，這與自由基及存活率結果一致。核轉錄相關因子（Nrf2）是重要的轉錄因子，在氧化應激時被激活，由胞質轉移到核內啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達，增加細胞對氧化應激的抗性[19]。研究發現，T3添加1 h和2 h后，細胞核內誘導產生的Nrf2水平顯著提高，胞質內Nrf2水平減少，即T3處理會誘導大鼠肝細胞Nrf2活化。

4 結語

本研究結果顯示，加入T3可顯著提高細胞Nrf2的表達，同時，Nrf2的上游調控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1及HO-1的表達均顯著提高。但是本實驗測定的是細胞總的Nrf2的表達，下一步可以將T3處理的細胞進行核質分離，分別測定Nrf2水平的變化。

本實驗結果表明，T3可通過提高PI3K的表達從而提高Nrf2的表達，繼而提高下游Ⅱ相酶基因的表達，進而提高細胞內SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性，降低MDA生成，從而降低細胞自由基水平，提高細胞存活率，進而發揮抗氧化保護作用。但過高濃度T3反而可能因刺激細胞代謝增強，產生過多自由基而起促進氧化的作用。

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