樟芝提取物Fr.2組分對PDGF-BB活化CFSC-8B的抑制作用

王 靜， 耿 燕， 孫 青， 陸震鳴， 許正宏， 史勁松

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

肝纖維化是指許多慢性肝臟疾病發病過程中由各種致病因子所致肝內彌漫性細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）過度沉淀的病理過程[1]，進一步發展為肝硬化、肝衰竭，往往需要肝移植來根治。但由于器官來源嚴重短缺，許多病人在等待器官過程中死亡，這已成為我國一個重要的公共衛生問題[2]。

目前的研究認為，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是正常及纖維化肝臟中ECM的主要合成細胞，HSCs增殖與凋亡的失衡是肝纖維化發生的細胞生物學基礎[3]。研究表明，多種細胞因子參與肝纖維化的發生，血小板衍生生長因子（PDGF）是強大的促HSC增殖因子，PDGF以自分泌、旁分泌的方式參與HSCs活化，且有很強的促纖維生成作用，可以顯著促進I型膠原合成[4]。

樟芝（Antrodia cinnamomea）[5]是一種僅分布在我國臺灣地區的珍稀擔子菌。據國內外文獻報道，樟芝子實體及菌絲體中含有眾多生理活性物質，如三萜類化合物、多糖、SOD、腺苷、小分子蛋白質及固醇類物質等[5]?，F代藥理研究已證實，樟芝子實體及其發酵產物在保肝[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]方面具有獨特的功效。樟芝深層液態發酵產物的粗提取物已被證實對CCl4誘發的肝損傷及肝纖維化節結和二甲基亞硝胺（DMN）造成的肝纖維化都有明顯的阻礙作用[6，9]，但是其活性組分及作用機制研究還未見報道。

筆者前期從樟芝菌粉中分離得到Fr.2組分，具有較強的抗肝纖維化活性，但其作用機制還需進一步研究。水飛薊賓（Silybin）是從水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮化合物，具有抗肝纖維化活性[10]。因此，本實驗中以Fr.2為研究對象，以Silybin為陽性對照物，通過構建PDGF-BB活化的CFSC-8B細胞模型，檢測Fr.2對PDGF-BB刺激的CFSC-8B細胞增殖及遷移效果，探討其抗肝纖維化的作用機制，旨在為深入研究樟芝防治肝纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 器材

1.1.1 材料與試劑 樟芝菌粉購自金穎生物科技股份有限公司，樟芝菌粉采用甲醇浸提，正己烷-水以體積比1∶1萃取，將正己烷萃取物通過硅膠柱色譜進行層析，獲得組分Fraction2（Fr.2），用于開展抗肝纖維化研究；RPMI-1640培養基，胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；胰酶-EDTA消化液，青霉素，鏈霉素，購自碧云天公司；Silybin及MTT，購自美國Sigma公司；WST-1細胞增殖試劑盒，TRIZOL，FastStart Universal SYBR Green Master，細胞裂解液，購自美國Roche公司；MAPK信號通路抗體，購自Cell Signaling Technology公司；其余試劑為分析純，購自國藥集團化學有限公司。

1.1.2 實驗細胞 大鼠肝星狀細胞株 CFSC-8B，購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫。細胞培養液為RPMI-1640培養基，內含質量分數10%FBS、青霉素和鏈霉素，在37℃，質量分數5%CO2的培養箱中培養，細胞匯集至80%時進行傳代接種，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.3 儀器 EL204電子天平，博特勒托利多公司制造；MULTISKAN ASCENT酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司制造；CO2培養箱，Thermo公司制造；倒置顯微鏡，Nikon公司制造；PCR擴增儀，Bio-Rad公司制造。

1.2 方法

1.2.1 體外PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞增殖模型的構建 將處于對數生長期的CFSC-8B細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，24 h后用含有體積分數0.5%FBS的培養基饑餓細胞24 h，加入不同質量濃度的 PDGF-BB （0、5、10、20 ng/mL），每組設 6個復孔，分別作用 24、36、48、72 h后，每孔加入10 μL WST-1，在細胞培養箱中作用1 h后，用酶標儀檢測450 nm的OD值，參考波長為690 nm。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 將CFSC-8B細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板，37℃培養24 h后，加入Fr.2組分，使每孔終質量濃度分別為3、6、12、25、50、100 μg/mL，每組設 6 個復孔，分別作用24、36、48、72 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液10 μL，繼續培養4 h后小心吸去孔內培養液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min使紫色結晶充分溶解，在酶標儀上測570 nm處OD值[11]。通過公式（2）及Graphpad軟件計算細胞存活率及IC50值。

1.2.3 細胞劃痕法檢測細胞遷移 調整對數期CFSC-8B細胞懸液濃度至3×105個/mL，以每孔1 mL細胞懸液接種到6孔板內，待細胞生長至90%～100%融合度時，以體積分數0.5%FBS饑餓細胞24 h。用200 μL槍頭垂直插入孔中劃痕。PBS洗滌細胞，加入含有體積分數0.5%FBS培養基配制的不同質量濃度的 Fr.2 溶液及 Silybin（25 μmol/L）。每隔一定時間對細胞取樣拍照，使用Image J軟件計算劃痕面積，以劃痕面積的變化值定義細胞遷移率。

1.2.4 細胞小室遷移實驗檢測細胞遷移 Transwell小室濾膜為8 μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜（Millipore公司），調整對數生長期懸液濃度至2×105個/mL，加入 100 μL 于上室，將 Transwell小室放入預先加入500 μL含有體積分數10%FBS細胞培養基的24孔板中。加入不同質量濃度的Fr.2及Silybin（25 μmol/L）后繼續在培養箱常規培養 24 h。取出濾膜，用棉簽擦去上室濾膜內表面殘存細胞，對遷移至濾膜外表面的細胞用質量分數4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，質量分數0.1%結晶紫染色，用體積分數33%醋酸脫色抽提10 min，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液在酶標儀上于570 nm處測定OD值，間接反映細胞數。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測相關基因表達情況 采用TRIZOL法，按試劑盒說明書提取總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green進行熒光定量PCR反應。采用2-ΔΔCt法對α-SMA、Collagen I （Col 1）、Collagen Ⅲ （Col 3）和Fibronectin（Fn）基因的表達水平進行相對定量，計算各相關基因的表達倍數[12]，相關基因引物序列采用文獻[13-14]所述。

1.2.6 蛋白質印跡（Western Blotting） 用4℃預冷的PBS洗滌細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的總蛋白質抽提試劑，于冰上裂解30 min，超聲處理30 s以降解DNA。裂解產物在4℃下12 000 g離心10 min后得到細胞蛋白質上清液，采用BCA蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質濃度。經SDS-PAGE電泳后在冰浴條件下將凝膠上的蛋白質電轉移至PVDF膜（Millipore公司）上，分別孵育一抗和二抗。ECL試劑盒（Thermo Scientific）顯色，利用Image J軟件分析蛋白質條帶灰度值。

1.2.7 數據統計 根據One-Way ANOVA統計學處理實驗結果，結果用平均值±標準差（mean±SD）表示，極顯著水平為與對照組比較##P＜0.01，與PDGFBB誘導組比較**P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 體外PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞增殖模型的建立

由表1可知，5～20 ng/mL范圍的PDGF-BB可誘導CFSC-8B細胞增殖，與對照組相比，差異極顯著（**P＜0.01），呈現劑量及時間依賴性。PDGF-BB 20 ng/mL和10 ng/mL促增殖作用相比差異不顯著，所以選擇10 ng/mL PDGF-BB作用CFSC-8B細胞48 h為最佳細胞增殖模型。

表1 PDGF-BB質量濃度和孵育時間對CFSC-8B細胞增殖率的影響Table 1 Proliferation effect of PDGF-BB on CFSC-8B cells，Proliferation %

2.2 Fr.2對CFSC-8B細胞生長的影響

如圖1所示，不同質量濃度的Fr.2作用CFSC-8B細胞不同時間后，細胞存活率受到不同程度的抑制。細胞存活率隨著作用時間及Fr.2質量濃度增加而呈逐漸下降趨勢，Fr.2在0～12 μg/mL范圍內對CFSC-8B細胞存活率無明顯抑制，其細胞存活率均在90%以上；但在高質量濃度的Fr.2作用下，CFSC-8B細胞出現了較多的死亡，表現出明顯的細胞生長抑制效應，本實驗中選定Fr.2 0～25 μg/mL的范圍與CFSC-8B細胞孵育48 h進行后續研究。通過Graphpad分析得出Fr.2與CFSC-8B細胞共孵育 48 h的 IC50值為 56.46 μg/mL。

2.3 Fr.2對PDGF-BB誘導CFSC-8B細胞增殖的影響

采用體外PDGF-BB誘導CFSC-8B細胞增殖模型，檢測了Fr.2對PDGF-BB刺激的CFSC-8B細胞增殖的影響（圖2），10 ng/mL PDGF-BB可極顯著誘導 CFSC-8B 細胞增殖（##P＜0.01），而 6、12、25 μg/mL Fr.2可極顯著抑制PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞增殖（**P＜0.01），且具有劑量依賴性，其中 25 μg/mL Fr.2的抑制率為71.8%，這與陽性對照Silybin（25 μmol/L）的抑制率（70.8%）相當。

圖1 Fr.2對CFSC-8B細胞存活率的影響Fig.1 Effect of Fr.2 on the cell proliferation in CFSC-8B cells

圖2 不同質量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Fr.2 on the cell proliferation induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.4 Fr.2對PDGF-BB誘導CFSC-8B細胞遷移的影響

HSCs向肝內炎癥區域遷移，可導致炎癥區域活化的HSCs數目增多，加重病灶局部的纖維化程度。所以，如能抑制HSCs在肝損傷時向炎癥區域遷移，就可能干擾或減輕纖維化進程。

細胞劃痕實驗顯示，各實驗組中CFSC-8B細胞從劃痕邊緣向劃痕內遷移，24 h后遷移的細胞呈單層鋪路卵石樣排列（圖3（a））；與對照組比較，計算各區域細胞遷移率（圖3（b））。結果表明，PDGF-BB刺激24 h后，細胞遷移的距離明顯高于對照組（##P＜0.01），Fr.2（6、12、25 μg/mL）與 PDGF-BB 細胞共孵育組細胞遷移率顯著低于PDGF-BB組（**P＜0.01），說明一定劑量的Fr.2可抑制PDGF-BB誘導的細胞遷移。

圖3 不同質量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導的細胞劃痕損傷的作用Fig.3 Effect of Fr.2 on the cell scratch wound induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

細胞小室遷移實驗進一步驗證了Fr.2對PDGF-BB誘導CFSC-8B細胞遷移有抑制作用，結果如圖4所示。

PDGF-BB可顯著誘導CFSC-8B細胞遷移，與對照組相比差異極顯著（##P＜0.01）。Fr.2可顯著抑制PDGF-BB 誘導的 CFSC-8B 細胞遷移（**P＜0.01），呈現劑量依賴性。25 μg/mL Fr.2細胞遷移抑制率為65.0%，而25 μmol/L Silybin的抑制率為 69.1%，結果表明25 μg/mL Fr.2抑制細胞遷移的效果優于Silybin。

圖4 不同質量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞遷移的作用Fig.4 Effect of different concentrations of Fr.2 on the cell migration induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.5 Fr.2對CFSC-8B細胞肝纖維化相關基因表達情況的影響

在分子水平上進一步檢測Fr.2對于PDGF-BB誘導的HSC活化及細胞外基質表達的影響。圖5 qRT-PCR結果顯示，10 ng/mL PDGF-BB可顯著誘導HSCs活化標記α-SMA基因表達，并顯著上調細胞外基質 Col1、Col3 及 Fn 基因表達（##P＜0.01）。 而Fr.2 （6、12、25 μg/mL） 顯著抑制 PDGF-BB 誘導的α-SMA、Col1、Col3 及 Fn 基因表達（**P＜0.01），且具有劑量相關性（圖 5）。

2.6 Fr.2對MAPK信號通路的影響

在明確了Fr.2組分對CFSC-8B細胞增殖、遷移及肝纖維化相關基因表達的抑制作用后，進一步研究了其對PDGF介導的MAPK信號轉導途徑的影響。

如圖6所示，對照組的信號轉導途徑處于低水平狀態，PDGF-BB誘導的CFSC-8B細胞MAPK途徑下游信號分子，如磷酸化Extracellular signalregulated kinase （p-ERK）、 磷酸化 c-Jun NH2-terminal kinase（p-JNK），及磷酸化P38 mitogenactivated protein kinases（p-P38），它們的表達較正常對照組明顯增強（##P＜0.01）。用Fr.2處理細胞后，PDGF-BB誘導的 CFSC-8B細胞 p-ERK、p-JNK、p-P38 的表達受到抑制（**P＜0.01）。

圖 5 不同質 量 濃 度 Fr.2對 α-SMA、Col1、Col3及 Fn mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effect of Fr.2 on the relative expression of α-SMA、Col1、Col3 and Fn mRNA

3 結語

圖6 Fr.2對 CFSC-8B細胞 p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白質表達的影響Fig.6 Effect of Fr.2 on expression of p-ERK、p-JNK、p-P38 in CFSC-8B cells

過去認為肝纖維化是持續的不可逆的過程，但目前有病例稱重度肝纖維化仍可逆轉，這極大激發了研究人員從事開發抗肝纖維化藥物[15]。通過抑制HSCs活化來控制肝纖維化，已成為醫藥領域的研究熱點。

HSCs是位于Disse間隙的一種間質細胞，正常情況下處于靜息狀態，經多種細胞因子刺激活化后HSCs大量增殖，合成包括膠原在內的各種細胞外基質，最終導致肝臟內膠原的異常沉積而發展成為纖維化[3]。其中PDGF是重要的促有絲分裂因子，可通過激活MAPK信號通路，促進HSCs增殖和細胞外基質如膠原表達增加[16]。

作者構建了體外PDGF-BB活化的CFSC-8B細胞模型，進一步利用此模型檢測Fr.2對CFSC-8B細胞的作用。 結果表明：Fr.2（6～25 μg/mL）能抑制PDGF-BB誘導CFSC-8B細胞的增殖及遷移，且呈劑量依賴性。并顯著降低PDGF-BB誘導的α-SMA、Col1、Col3及Fn基因表達水平。

MAPK通路有調控細胞增殖、分化、凋亡及細胞間功能同步化等重要功能，MAPK蛋白質家族包括ERK、JNK和P38[17]。MAPK途徑也是HSCs中重要的細胞內信號轉導途徑。研究顯示，Fr.2可抑制PDGF-BB誘導MAPK信號轉導中p-ERK、p-JNK及p-P38表達。由此推測Fr.2可能通過阻止CFSC-8B細胞增殖及向損傷部位遷移，下調細胞外基質的表達，從而阻止肝纖維化的發生，其機制可能與抑制胞內MAPK信號轉導通路有關。

對樟芝提取物的Fr.2組分進一步分離，并鑒定其活性化合物的結構，進而研究其抗肝纖維化的機制，將有助于抗肝纖維化藥物的研制。

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