宮頸上皮內瘤變患者淋巴細胞亞群的分析

呂江濤，孫婷婷，陳飛，譚先杰

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，北京協和醫院婦產科，北京 100730）

宮頸 上 皮 內 瘤 變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是由高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續感染引起的一種較常見的宮頸疾病。根據異常細胞所占宮頸上皮層范圍的不同，可以將CIN 由輕到重分為CIN1、CIN2、CIN3（包括原位癌）三級。已經清楚，高危型HPV 感染是CIN 和宮頸癌的必要條件，但非充分條件。有資料表明，婦女一生中感染HPV 的機會高達80%，但多數婦女可在數月之內清除病毒，僅少數演變為持續感染，進而發展成為CIN 甚至宮頸癌［1］。這一現象表明，大多數婦女具備完善的防御機制對抗和清除HPV，僅少數婦女的防御機制存在缺陷。研究提示HPV 的清除失敗與機體的細胞免疫功能異常有關［2］，但關于CIN 患者的全身免疫功能的研究尚少。本研究通過對不同級別的CIN 患者的外周血進行T 淋巴細胞亞群的檢測，以進一步了解CIN 患者的全身免疫功能的變化。

資料與方法

一、研究方案

在2013年7月～2013年12月，前瞻性招募于我院門診就診的宮頸病變患者，與患者簽署知情同意書之后將其入組研究。所有患者均有液基細胞學檢查（TCT）以及HPV的雜交捕獲二代技術（HC2）定量檢測結果。納入條件有：（1）TCT 結果為低度上皮內瘤變（LSIL）及以上；（2）TCT 為不明確意義的不典型鱗狀上皮（ASC-US），高危型HPV 的HC2數值＞1.0。排除條件有：（1）全身的急、慢性感染性疾病；（2）血液系統疾病；（3）確診為腫瘤患者。所有患者在納入之后，均進行陰道鏡檢查及多點活檢。在活檢之前行術前檢查，額外抽取患者2ml外周血。

二、主要儀器設備和試劑

主要儀器包括FACS 流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）和離心機（安亭儀器廠）。主要試劑包括IgG1-異硫氰酸熒光素（FITC）、HLA-DRFITC、CD45RA-FITC、CD45RO-PE、CD38-FITC、CD3-PC5、CD4-PC7、CD8-PC7、溶 血 素（Beckman Coulter，美國）以及PBS溶液（自配）。

三、實驗方法

采集患者2ml外周血，從體檢中心獲得20份健康女性的外周血標本。乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，20h 內進一步處理。根據實驗目的，將抗體進行如下組合：IgG1-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；人類白 細 胞 抗 原（HLA）-DR-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；HLA-DR-FITC／CD3-PC5／CD8-PC7；CD38-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；CD38-FITC／CD3-PC5／CD8-PC7 為三色方案。IgG1-FITC／IgG1-PE／CD3-PC5／CD4-PC7；CD45RA-FITC／CD45RO-PE／CD3-PC5／CD4-PC7；CD45RA-FITC／CD45RO-PE／CD3-PC5／CD8-PC7為四色方案。取8只試管，向其中加入100μl抗凝全血，分別加入上述8種抗體組合，振蕩均勻后避光孵育15min。FITC、PE 標記的抗體加入量為10μl，PC5、PC7標記的抗體加入量為5μl。每管中分別加入500μl的溶血素，充分振蕩均勻以保證紅細胞完全碎裂，避光放置10min。每管中加入500μl的PBS緩沖液，混合均勻后離心（1 500r／min，5min）。棄上清液后，再向每管加入500μl的PBS緩沖液，混合均勻后進行流式細胞儀的檢測。流式細胞儀獲得數據之后，利用軟件CELL QUEST 進行熒光參數分析。調整電壓及根據同型對照進行顏色補償，以淋巴細胞設門，讀取免疫表型為CD3＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋CD38＋、CD3＋CD4＋HLA-DR＋、CD3＋CD8＋CD38＋、CD3＋CD8＋HLADR＋、CD3＋CD4＋CD45RO＋CD45RA-、CD3＋CD4＋CD45RO-CD45RA＋、CD3＋CD8＋CD45RO-CD45RA＋、CD3＋CD8＋CD45RO-CD45RA＋亞群的百分比。

四、統計學分析

采用SPSS 18.0軟件行統計學分析。各淋巴細胞亞群的百分率均用均值±標準差表示，方差分析用于多組間均數比較，Dunnett法用于各患者組與健康對照組的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、基本情況

本研究共收集38 例CIN 患者的外周血，其中CIN1 12例、CIN2 15例、CIN3 11例。與20例對照組相比，各組患者在年齡、孕產次、HC2值方面沒有顯著性差異。圖1以CD3＋CD4＋CD38＋T 細胞的分析過程為例，說明三色方案分析淋巴細胞亞群的過程。A圖中縱坐標為前向散射光（forward scatter light，FS），與標本中細胞的大小有關，橫坐標為側向散射光（side scatter light，SS），與標本中血細胞表面被熒光染料標記的細胞數有關。B圖中被圈出的細胞為CD3＋T細胞，占所有白細胞總數的40.7%。C 圖中橫坐標為CD3的表達量，縱坐標為CD4的表達量，CD3＋T 細胞被較好地劃分為CD3＋CD4＋T 細胞和CD3＋CD4-T 細 胞。D 圖 中 縱 坐 標 為CD38 的 表 達 量，得 到CD3＋CD4＋CD38＋T 細胞占CD3＋CD4＋T 細胞的比例為26.6%。同理，圖2以CD3＋CD4＋CD45RO＋T細胞和CD3＋CD4＋CD45RA＋T 細胞的分析過程為例，說明四色方案分析淋巴細胞亞群的過程。

圖1 三色方案分析淋巴細胞亞群

圖2 四色方案分析淋巴細胞亞群

二、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的分析結果

與健康對照相比，CIN 患者的CD4＋T 細胞比例有逐漸下降的趨勢，而CD8＋T 細胞比例有逐漸增加的趨勢，但是各組間的差異均沒有統計學意義。CD4＋T細胞／CD8＋T細胞的比值隨宮頸病變級別增加下降的趨勢。CIN2 患者（1.05±0.52）與對照組（1.46±0.43）相比及CIN3患者（0.99±0.58）與對照組相比，CD4＋T 細胞／CD8＋T 細胞的比值均有顯著性差異（表1）。

三、CIN患者T淋巴細胞亞群的細分結果

進一步利用流式細胞技術對CD4＋T 細胞和CD8＋T 細胞的亞群進行細分。結果發現CD8＋T細胞的激活亞群（CD38、HLA-DR），CD4＋T 細胞和CD8＋T 細胞的純真亞群（CD45RA）、記憶亞群（CD45RO）在各組之間沒有明顯的統計學差異。而CIN3患者的CD4＋T 細胞中的激活亞群（HLA-DR）的比例與健康對照組比較有顯著增加（表2）。

表1 CIN 患者CD4＋T 細胞和CD8＋T 細胞的分析（±s）

表1 CIN 患者CD4＋T 細胞和CD8＋T 細胞的分析（±s）

注：與健康對照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋／CD8＋健康對照 20 33.4±7.9 24.5±6.6 1.46±0.43 CIN1級 12 31.9±8.2 25.6±8.1 1.25±0.47 CIN2級 15 29.8±8.4 28.1±7.2 1.05±0.52＊CIN3級 11 28.8±7.9 29.5±8.8 0.99±0.58＊

表2 CIN 患者T 淋巴細胞亞群的細分結果［（±s）%］

表2 CIN 患者T 淋巴細胞亞群的細分結果［（±s）%］

注：與健康對照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數 CD38＋CD4＋／CD4＋ HLA-DR＋CD4＋／CD4＋ CD38＋CD8＋／CD8＋ HLA-DR＋CD8＋／CD8＋健康對照20 31.7± 8.6 11.5±5.4 18.2±6.1 52.4±9.2 CIN1級 12 30.5±10.4 14.2±7.5 21.3±7.5 51.3±8.1 CIN2級 15 27.6± 7.3 16.3±6.4 16.5±5.3 47.5±8.8 CIN3級 11 28.1±11.5 17.8±6.1＊ 17.5±5.9 49.4±7.3組 別 例數 CD4＋CD45RO＋CD45RA-／CD4＋CD4＋CD45ROCD45RA＋／CD4＋CD8＋CD45RO＋CD45RA-／CD8＋CD8＋CD45ROCD45RA＋／CD8＋健康對照20 56.8±14.2 42.2±12.8 32.6± 9.2 65.0±11.3 CIN1級 12 57.2±10.6 42.5±11.3 33.5±10.8 64.1±10.6 CIN2級 15 60.3±15.3 40.6±12.6 39.2±10.9 64.7± 9.3 CIN3級11 57.7±13.9 42.8±17.2 40.2±11.4 60.5±11.3

討 論

T 淋巴細胞是人體細胞免疫系統中具有重要功能的細胞群。在正常機體中，只有各T 淋巴細胞亞群相互作用并維持一定的比例，才能確保人體免疫功能的正常作用。人體免疫系統紊亂的發生與不同淋巴細胞亞群的功能和數量發生異常有密切關聯。人體感染了人免疫缺陷病毒（HIV）后，主要病理過程就是T 淋巴細胞免疫系統受損，尤其是CD4＋T淋巴細胞遭到損害，導致各種機會性感染和腫瘤［3］。HIV 感染導致免疫功能異常，特別是細胞免疫功能受損會大大增加感染HPV 的風險，而且感染后容易進展成為CIN 和宮頸癌［4］。

HPV 是一種嗜上皮細胞病毒，病毒不進入血液中復制，因此HPV 導致的免疫系統變化應該與HIV 有很大不同。上皮細胞感染HPV 之后，并不會導致細胞崩解，病毒復制和裝配都發生在細胞內，等待細胞死亡之后，再釋放出大量的完整病毒顆粒［5］。在這個過程當中，沒有炎癥發生，機體也就不會啟動針對HPV 的免疫清除機制［6］。盡管HPV感染之后，機體產生的抗體微乎其微，但是以病毒包膜蛋白為主要成分的HPV 預防性疫苗卻取得了顯著的效果［7］。然而，在已經被HPV 感染甚至已經出現CIN 病變的患者中，起主要清除病變作用的是機體的細胞免疫功能［2］。

CD4＋T 淋巴細胞／CD8＋T 淋巴細胞的比值是反映系統細胞免疫功能的重要指標之一。本研究通過特異性熒光抗體標記，用流式細胞儀對38 例宮頸上皮內瘤變患者的外周血進行了T 淋巴細胞亞群的檢測。結果發現，與健康對照相比CIN 患者的CD4＋T 細胞和CD8＋T 細胞的比例均沒有顯著性變化，但CIN2患者和CIN3患者的CD4＋T 細胞／CD8＋T 細胞的比值顯著下降。這表明CIN 患者確實存在機體的全身細胞免疫功能異常，提示CIN 患者存在CD8＋T 細胞相對增加而帶來的細胞毒免疫的增強和CD4＋T 細胞相對下降而帶來T 輔助細胞比例異常的現象。導致此現象的原因可能是機體的免疫應答受到了HPV 感染或者異型增生的宮頸鱗狀上皮細胞的影響，導致外周血中CD4＋T 淋巴細胞減少，γ-干擾素、白細胞介素-2等細胞因子水平下降，自然殺傷細胞活性降低、數量減少。

HIV 感染發病后，人體免疫系統主要表現為CD4＋T 細胞計數減少，特別是純真CD4 細胞（CD4＋CD45RA＋）數目下降；功能亞群（CD28＋）表達降低；CD8 細胞激活亞群（CD8＋CD38＋、CD8＋HLA-DR＋）增加，并與HIV 的病毒載量呈正相關［3］。研究發現，在HPV 持續感染的年老婦女的外周血中，表達CD69和HLA-DR 的激活亞群以及CD8＋T 細 胞 的 分 化 記 憶 亞 群（CD45RO＋CD27-CD8＋）出現顯著性增加［8］。本研究的獨創之處在于在CIN 患者中進行T 淋巴細胞亞群的細分研究。結果發現，與健康對照組相比CIN3患者的CD4＋T細胞中的激活亞群比例增加，提示盡管CIN 患者隨著病情加重CD4＋T 細胞的相對數目下降，但是卻存在異常比例的激活亞群。這可能是CIN 病變加重的原因，也可能是高級別CIN 病變的結果。在離體實驗中，HPV 持續感染的人群的外周血單個核細胞對促有絲分裂原和抗原的刺激反應減弱［9］。結合此項研究的結果，我們可以推論慢性HPV 感染引起的CIN 病變，盡管僅存在于宮頸局部，但仍可以引起外周血T 細胞亞群的比例變化。

本研究通過對CIN 患者的CD4＋T 細胞和CD8＋T 淋巴細胞進行了分析，同時還對它們的細胞表面分化標記進行研究，從而發現了CIN 患者的系統免疫功能的異常。這為CIN 患者的免疫治療提供了理論基礎。但是由于本研究屬于單個時間點的橫斷面研究而且納入的病例數較少，暫不能判斷CIN 患者的全身免疫功能的異常是疾病引起的結果還是導致疾病進展的原因。未來的工作將擴大樣本量，并在多個時間點連續觀察CIN 患者的系統免疫功能變化，以更好地理解HPV 感染導致的CIN病變與人體免疫系統的關系。

［1］ 邢志艷，徐東艷，郝百連，等.955 例婦科就診婦女人乳頭瘤病毒 感 染 篩 查 結 果 分 析［J］.生 殖 醫 學 雜 志，2013，22：951-953.

［2］ Stanley MA.Immune responses to human papilloma viruses［J］.Indian J Med Res，2009，130：266-276.

［3］ Chakrabarti LA，Simon V.Immune mechanisms of HIV control［J］.Curr Opin Immunol，2010，22：488-496.

［4］ van der Burg SH，Palefsky JM.Human immunodeficiency virus and human papilloma virus-why HPV-induced lesions do not spontaneously resolve and why therapeutic vaccination can be successful［J］.J Transl Med，2009，7：108.

［5］ Stanley MA.Epithelial cell responses to infection with human papillomavirus［J］.Clin Microbiol Rev，2012，25：215-222.

［6］ Kanodia S，Fahey LM，Kast WM.Mechanisms used by human papillomaviruses to escape the host immune response［J］.Curr Cancer drug Tar，2007，7：79-89.

［7］ Paavonen J，Jenkins D，Bosch FX，et al.Efficacy of a prophylactic adjuvanted bivalent L1virus-like-particle vaccine against infection with human papillomavirus types 16and 18 in young women：an interim analysis of a phase III doubleblind，randomised controlled trial［J］.Lancet，2007，369：2161-2170.

［8］ Rodriguez AC，Garcia-Pineres AJ，Hildesheim A，et al.Alterations of T-cell surface markers in older women with persistent human papillomavirus infection［J］.Int J Cancer，2011，128：597-607.

［9］ Garcia-Pineres AJ，Hildesheim A，Herrero R，et al.Persistent human papillomavirus infection is associated with a generalized decrease in immune responsiveness in older women［J］.Cancer Res，2006，66：11070-11076.