直接免疫熒光法檢驗狂犬病毒毒價和滅活效果試驗

文│張傳明 蔣雯雯 楊敏 虞華芳（江蘇省常州同泰生物藥業科技有限公司）

直接免疫熒光法檢測狂犬病毒毒價比小鼠腦內接種法約高100.17～100.50，呈平行關系，并且兩者做滅活檢驗結果完全一致。所以，直接免疫熒光法可取代小鼠腦內接種法做狂犬病毒毒價檢測和滅活檢驗。

狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患病，遍布世界各地，我國是狂犬病的高發區。自從新中國成立以來，狂犬病有三次大流行。第一次是在20世紀50年代中期。第二次大流行是從20世紀70年代末期到90年代初期，此次流行共持續了十幾年，最高年份有多達7000人死于狂犬病。到20世紀90年代中期，由于人狂犬病疫苗的改進，發病人數逐年減少。但新世紀以來，隨著養犬數量的增加，狂犬病的發病人數又逐漸上升。據原衛生部統計，2006年發病人數已超過3000。預計今后有增加的趨勢。因為人狂犬病主要是犬貓等寵物咬傷人所致，所以預防狂犬病的主要環節是對犬貓進行100%免疫預防。世界上發達國家通過免疫犬貓等寵物，已經完全控制了寵物的狂犬病，幾十年來，再沒有報道人從寵物感染狂犬病的病例。南美各國在泛美衛生組織的帶領下，從20世紀80年代末普遍開展寵物免疫活動，經過10多年的努力，寵物的狂犬病得到了控制，人的狂犬病病例也因此大大下降。

近年來，我國狂犬病病例急速上升，與我國養犬數量增加有關。據農業部估計，國內養犬數量已超過1億只。這可能還是比較保守的估計。我國90%以上的狂犬病病人是由犬傳染的。犬貓等寵物的狂犬病防治主要靠預防性接種。在20世紀50年代，狂犬病弱毒株，比如ERA、SAD、LEP等，也曾用來免疫寵物或者野生動物，但發現這些弱毒活疫苗有返毒現象而引起疾病。所以，狂犬病病毒減毒活疫苗不再用于犬貓等寵物預防性接種。世界上其他國家目前所用的動物狂犬病疫苗都為滅活苗，多數是細胞培養疫苗，也有腦組織培養的疫苗。用于生產狂犬病病毒滅活苗的毒株包括PV、SAD、ERA、SAD、HEP等。目前我國生產的動物用狂犬病滅活疫苗的單位基本都是用小鼠腦內接種法檢測狂犬病毒的毒價和滅活效果，但用小鼠檢驗存在時間長、成本高、結果不穩定等較多不利因素。我們用直接免疫熒光法做了狂犬病毒毒價檢測和滅活效果檢測比較試驗，現將結果匯報如下。

一、試驗材料與方法

1.試驗材料。

（1）狂犬病SAD株病毒和BSR細胞均從美國Kansas State University引進，由常州同泰生物藥業科技有限公司培養傳代。

（2）熒光素（FITC）標記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體購于美國Fujirebio公司。

2.試驗動物。無特定病原體（SPF）小鼠，ICR品系，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

3.試驗方法。

（1）用小鼠腦內接種法檢測狂犬病毒毒價。將狂犬病毒液用磷酸鹽緩沖液（PBS）作10倍系列稀釋，取3個適宜稀釋度在11～13克的SPF小鼠腦內注射，每只0.03毫升，觀察14日，按Reed-Muench法計算半數致死量（LD50）。

（2）直接免疫熒光法檢測狂犬病毒毒價。

病毒稀釋。準備2塊96孔細胞培養板，先在第1塊96孔板每孔中加入180微升培養液；在第1列孔中加入20微升待檢病毒原液，充分混勻；從第1列孔中吸出20微升加入到第2列孔中，充分混勻；依次類推，直至加到最后一列孔；從第1列孔到第8列孔稀釋度分別為10-1～10-8；每個稀釋度6孔。

加樣。取出第2塊96孔板，將第1塊96孔板中的病毒稀釋液吸至第2塊96孔板的相應孔中，每孔100微升。

培養。在每孔中加入100微升含2×104BSR細胞懸液，混勻，置37℃、5% CO2培養箱培養48小時。

固定。棄掉96孔培養板中的培養液，用pH 7.2、0.07摩爾/升的PBS洗板1次，再用80%丙酮洗板1次，然后用80%丙酮室溫固定30分鐘，棄丙酮后置于室溫干燥。

熒光染色。每孔加入50微升工作濃度的熒光素標記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體，輕輕搖晃后放入濕盒中37℃孵育30分鐘；棄掉熒光標記核蛋白抗體，用PBS洗兩次；再吸掉多余的PBS。

觀察。置于熒光顯微鏡下觀察。通過熒光病灶形成的稀釋度及熒光病灶的孔數來計算病毒熒光灶單位（FFU）。

（3）用小鼠腦內接種法做狂犬病毒滅活檢驗。將滅活后的病毒原液在10只11～13克的SPF小鼠腦內接種，每只0.03毫升，觀察14日；14日后撲殺所有存活小鼠，取小鼠腦組織用含2%牛血清的生理鹽水制成10%的勻漿，混合離心，取上清，再次腦內接種11～13克的SPF小鼠10只，每只0.03毫升，觀察14日。接種后4日內死亡的小鼠屬非特異性死亡，不計算在內；每組4日內死亡數應不超過1只。

（4）用直接免疫熒光法做狂犬病毒滅活檢驗。取滅活病毒液，10倍稀釋后接種于已長成良好單層的BSR細胞，每個樣品接種4只T25瓶，置33～35℃孵育1小時后棄去接種液，加病毒維持液5毫升繼續培養7日，同時設未接種的BSR細胞做空白對照。7日后盲傳1代，再繼續培養7日。棄掉細瓶中的培養液，用PBS洗滌1次，再用80%丙酮洗滌一次，然后用80%丙酮室溫固定30分鐘，棄丙酮后置于室溫干燥；每瓶加入1毫升工作濃度的熒光素標記的抗狂犬病病毒核蛋白抗體，37℃孵育30分鐘；棄掉熒光標記核蛋白抗體，用PBS洗2次，晾干后在熒光顯微鏡下觀察。

二、結果

1.狂犬病毒毒價檢測。我們做了10批狂犬病毒的毒價檢測比較試驗，分別用小鼠腦內接種法和直接免疫熒光法（細胞）檢測病毒毒價，結果見表1。

從表1可以看，用兩種方法檢測狂犬病毒毒價的平行關系非常好，直接免疫熒光法檢測結果比小鼠腦內接種法約高100.17～100.50。

2.狂犬病毒滅活效果檢測。我們將上述10批病毒液滅活后，分別用小鼠腦內接種法和直接免疫熒光法檢測滅活效果，結果發現，兩種方法做出的滅活檢驗結果完全一致。

三、討論

1.小鼠腦內接種法的缺點。

（1）結果受試驗動物個體影響較大。不同批次的小鼠個體差異較大，有時小鼠較為敏感，死亡率偏高，有時死亡率又會偏低，因此同樣一個病毒樣品，不同時間檢測、不同人員檢測，或用不同批次的小鼠檢測，都會產生不同的結果，造成該試驗的重復性不高。

表1 狂犬病毒毒價檢測結果

（2）由于需要對小鼠進行腦內注射病毒液，對試驗人員的操作技能要求較高，對小鼠的注射部位、接種量要非常準確，接種部位稍有偏差，劑量稍有變化都會影響毒價檢測結果，經常造成一些小鼠因接種操作而造成非特異性死亡。

（3）檢測時間長，滅活檢驗每次接種小鼠后需觀察14天，兩次接種至少需要28天；毒價檢測至少需14天。

（4）檢測成本高，每個滅活樣品至少需要20只SPF小鼠，每個毒價檢測樣品至少需要15只SPF小鼠，飼養成本和試驗動物房資源占用成本很高。

2.直接免疫熒光法的優點。

（1）操作方便。細胞培養和接種操作非常簡便，比接種小鼠腦腔相對容易掌握，不會造成動物非特異死亡所帶來的結果偏差，只需控制好細胞無菌培養即可。

（2）結果客觀可靠。細胞培養條件相對比較好控制，不存在試驗動物的個體差異因素，不同批次的細胞均來源于同一株種細胞，因此不同時間培養的細胞差異不大，只要控制好細胞的接種數，每次檢測的結果相對比較穩定，因此重復性比較好。

（3）檢測時間短。病毒毒價檢測僅需48小時，為小鼠腦內接種法的1/7；滅活檢驗最多需14天，比小鼠腦內接種法縮短一半時間。

（4）檢測成本低。每個病毒樣品或滅活樣品僅需一些BSR細胞和熒光抗體，僅為小鼠腦內接種方法成本的1/4左右。

綜合以上兩種方法的優缺點，用直接免疫熒光方法檢測狂犬病毒的毒價和滅活效果取代小鼠腦內接種法是完全切實可行的。