奶牛早期妊娠診斷技術的應用

文│張晶 陳奎春 溫富勇 趙海明 張利娟（北京市密云縣農業局 現代農業產業技術體系北京市奶牛創新團隊）

目前北京市密云縣大多數奶牛養殖場對奶牛妊娠診斷還采用傳統的配種后60天進行直腸觸診法，既浪費人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。2014年4月密云縣引進了先進的奶牛早期妊娠診斷技術，使用“28天可視孕檢試劑盒”，對配種后28天的奶牛采血樣分離血清進行診斷，該技術將奶牛妊娠診斷時間提前了30天，一頭奶牛可節省30天的飼養成本，增加奶產量，節約飼料成本，降低了產犢間隔，改善繁殖狀況，并減少對妊檢人員身體的傷害，避免了人畜傳染病的發生。目前，該項技術已在密云縣7個奶牛養殖場進行應用，特異性達到了96%以上。本文簡述了通過對懷孕奶牛早期產生相關糖蛋白的檢測，來判定奶牛是否妊娠的早期診斷方法的操作及對養牛業應用的意義。

表1 早期妊娠診斷技術的準確性實驗

一、奶牛早期妊娠診技術的意義和原理

1.奶牛早期妊診斷的意義。目前，密云縣共有奶牛場31家，共有7家使用此項技術，2013年以前密云地區大多數牛場使用的妊娠診斷方法都是直腸觸診法，既浪費人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。

對牛精準及時的懷孕檢測在當今的牧場繁殖管理程序中是一項十分重要的內容。獸醫和牧場工作人員對牛進行早期懷孕檢測，查找出空懷牛，這樣可以盡快重配空懷牛以及縮短產犢間隔，從而為奶牛場帶來最高的牛奶產量和收益。

傳統上，通過對牛進行直腸觸診或超聲來診斷牛是否懷孕，一般45～60天以后才能監測出結果。早期妊娠診斷技術，可以早在配種后28天就檢測到牛是否懷孕，特異性在96%～99%，該診斷方法為獸醫和奶牛場的工作人員提供了檢測懷孕牛的重要工具，給養殖戶帶來很大的經濟效益。以1000頭規模的奶牛場為例，泌乳牛繁殖率可從75%提高到80%，產間距可以從16個月下降到15個月，空懷天數可以下降30天，即1000頭×30天×30元/天＝900000元，將牛群空懷天數下降30天，可以為牧場帶來90萬元的效益。

表2 久興奶牛場試驗應用情況

2.早期可視孕檢的原理。早期可視孕檢試劑盒是根據酶聯免疫反應原理設計的，用于檢測懷孕早期存在于牛血清的懷孕相關蛋白（PAGs），這類蛋白可以作為牛懷孕的標志。微孔板已經包被PAG抗體，將待檢樣品在包被板上進行稀釋并孵育后，捕獲到的懷孕相關蛋白（PAGs）可以與特異性的PAG抗體（檢測溶液）和辣根過氧化物酶標記物（酶標抗體）結合。未被結合的酶標抗體則被洗掉，隨后在孔內加入TMB底物溶液。孔內溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例。

二、此項技術在密云地區奶牛場的應用

1.技術操作過程及要求。

（1）采取配種后28天以上奶牛的血樣。對配種28天以上奶牛的血樣進行分離血清，已備檢測。

（2）試驗操作程序。

第一步，試劑準備。

在使用之前，所有的試劑盒組分都必須恢復到18～26℃。試劑應通過輕輕渦旋、旋轉混合均勻。每個樣本都使用不同的吸頭。濃縮洗滌液要使用蒸餾水或去離子水進行10倍稀釋。

第二步，在酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）板中加入樣品及試劑。

在所有樣品和對照孔內滴加一滴樣品稀釋液。使用試劑盒內提供的移液器和附帶的吸頭，吸取陰性對照并分別加入兩個孔內。吸取陽性對照并分別加入兩個孔內。吸取樣品（血清）并加入適當孔內。不同樣品需更換吸頭。輕彈微量反應板將反應板中的溶液混勻，蓋好蓋板，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板：移除蓋板，快速翻轉反應板，將板孔內液體棄入廢液缸或水槽。用裝有洗滌溶液的洗瓶洗板3～5次。每次洗滌后快速翻轉反應板，棄去洗滌溶液。在最后一次洗滌完后，將反應板在吸水紙上拍干。

第三步，加入檢測溶液。

在每個反應孔中加入2滴檢測溶液。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第四步，加入酶標抗體。

在每個反應孔中加入2滴酶標抗體。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第五步，加入底物液和終止液。

在每個反應孔中加入2滴TMB底物溶液。在18～26℃條件下孵育15分鐘（可以有誤差1分鐘）。在每個反應孔中加入2滴終止液終止反應。在加終止液時要按加入底物溶液的順序進行滴加。輕彈微量反應板將反應板中的溶液混勻。肉眼進行讀板，對照孔呈藍色的為陽性。

第六步，讀板及結果判定。

動物的懷孕狀態是由肉眼觀察孔內顏色決定的。如未觀察到藍色，顏色與陰性對照孔顏色相似，則此動物被認為是空懷。如觀察到藍色，則存在PAGs，此動物被認為是懷孕。如樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認為可疑/疑似，推薦懷孕復檢。

2.應用情況。

（1）為進一步驗證該試劑的準確性，在一奶牛場采集奶牛血樣17頭份，其中包括直腸檢查已確定妊娠的奶牛，沒配種的空懷牛奶牛和配種后待檢奶牛。具體情況如表1。

經檢測，其中2頭已懷孕奶牛檢測結果為陽性，2頭未配種的奶牛檢測結果為陰性，說明早期妊娠診斷試劑盒的準確率為100%。

（2）應用的效果分析。2014年5月21日對密云縣十里堡鎮久興奶牛場的24頭待檢奶牛進行檢測。具體情況如表2。

共檢測24頭奶牛，其中28～35天采血用早期妊娠診斷試劑盒檢測出18頭為陽性，6頭為陰性，60天直腸檢查18頭陽性牛中有3頭為陰性，陰性的原因有可能為早期胚胎死亡。

三、小結

在現代規模化牧場管理中，提高奶牛終生產奶量，改變牧場繁殖效益是養殖戶追求的目標。奶牛終身可以有更多的泌乳高峰，生產奶量的增加，較短的繁殖周期，可以提高繁殖性能和經濟效益，這必須通過縮短配種期來實現，這些就需要盡早診斷出已配奶牛是否已經懷孕。奶牛早期可視妊娠診技術具有操作簡便，準確率高，增加奶產量，節約飼料成本等優點，所以此項技術的應用對于養牛業具有重要的意義。