病毒性腦炎的病原學檢測與分析

李東瑞 丁雪冰 王雪晶 滕軍放

鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

腦炎是感染性疾病中較嚴重的一種，病毒是急性腦炎中最常見的感染源。病毒性腦炎是指病毒直接侵犯腦實質而引起的原發性腦炎，臨床表現主要為發熱、頭痛、意識障礙、癲癇、精神行為異常及神經系統定位體征。

1 流行病學

流行病學報告腦炎的發病率有很大的地理差異性，在正常情況下，年發病率3．5／100 000～7．5／100 000。雖然病毒性腦炎可影響各個年齡段，但在兒童期更加明顯［1-4］。

2 病原學分類

許多患者被診斷為腦炎，卻沒有檢測到特定的病原體。隨著分子生物學技術，特別是聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用及進步，特發性的病例相對比例可能會下降，但不到半數的患者能檢測出病原體，可能與未知的免疫相關性腦炎有關［5］。在全球范圍內及特殊地區發現的幾十種病毒和細菌可能引起腦炎［1］。見表1。

3 病原學檢測方法分析

不同類型VE的診斷技術類同，但目前普遍缺少病原學與基因組學的診斷方法。近年來病原學診斷方法的研究有很大進展。

3．1 病毒分離 目前被認為是病毒性腦炎診斷的金標準，特點是診斷特異性好，操作復雜，且成功率低，花費較高，臨床上較難普及。

3．2 病毒特異性抗體檢測 有數種病毒可在血清和腦脊液中通過酶免疫測定，如單純皰疹病毒1 型與2 型（HSV-1／HSV2）、水痘病毒（VZV）、EB病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、腺病毒、流感病毒等［6］。蛋白質印記法（Western blot）用于識別腦脊液及血清中的特異性抗體，在病毒感染性疾病中被作為確診實驗，但由于其敏感性較ELISA 低，因此未成為首選診斷技術。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢出率低，存在假陰性，并在許多檢測中都有相關報道［7-8］，主要有以下幾種原因：（1）試劑本事的質量問題；（2）操作過程中出現的問題；（3）鉤狀效應，即抗原-抗體需要在最適比濃度下進行，如有大量抗體存在同時其濃度大大超過抗原，可導致陰性結果。但隨著ELISA 方法的改良及進步，其敏感性逐漸升高，可用于大規模血清學監測。

表1 病原學

3．3 病毒抗原檢測 雖然在血清中HSV、VZV、RSV、流感病毒A、B以及腺病毒可通過傳統的免疫熒光法對其咽拭子標本進行抗原檢測，但由于腦脊液中抗原含量較低，檢出率較低，不能用于腦脊液病毒抗原檢測。

新型ELISA 方法基于雙抗體夾心模式，同樣可應用病毒抗原檢測。2001年BODE等曾用該方法檢測博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）的磷蛋白（p24）和核蛋白（p40）構象。該方法兼顧有較高的特異性及敏感性，同時有EILSA法的穩定性好、操作方便等優點。

3．4 聯合檢測 Bode等［9］研究也同時提出了BDV-CIC、有利抗體和血漿抗原檢測相同樣本的差異性，該方法檢測感染陽性率比單純血清學檢測敏感10倍以上，但仍需進一步研究是否用于大規模檢測。

3．5 應用聚合酶鏈式反應（PCR） CSF-PCR 是將CSF 中微量的病毒基因迅速擴增百萬倍，常規RT-PCR分反轉錄和擴增兩步驟，該方法是在同一體系下，同時進行反轉錄及PCR，可在短時間內完成，是早期快速診斷的常用方法。但由于PCR 技術敏感性較高，因此，在實驗操作中必須采取嚴格無菌措施防止污染，以提高診斷的特異性。

隨著PCR 技術的進步和擴展，目前已從最初的RT-PCR發展到與各項技術集合起來的新技術，如實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）、多重RT-PCR等。

實時熒光定量PCR 起源于1999年Scorpions引物的發現，后經改進誕生的二聚體Scorpion［10］、特異引物、PCR 終止物和熒光基團組成的一條寡核苷酸，淬滅劑結合在與探針完全互補的另一條寡核苷酸的3＇末端。熒光實時PCR 定量具有范圍寬、敏感性高、精度高、無PCR 后處理步驟，避免了交叉污染，同時可進行多重檢測等優點。

病毒性腦炎是中樞神經系統常見的感染性疾病，嚴重的顱內病毒感染可能會導致死亡，患者往往遺留永久性的神經后遺癥［11-14］。目前，支持對癥治療超過抗病毒治療［15-16］。因此，病毒性腦炎的病原學檢測尤為重要。通過對樣本的抗原、抗體及免疫復合物檢測以及分子生物學技術應用，為病毒性腦炎的診斷提供病原學依據，幫助診斷和治療病毒性腦炎患者。

［1］Granerod J，Crowcroft NS．The epidemiology of acute encephalitis［J］．Neuropsychol Rehabil，2007，406-428．

［2］Jmor F，Emsley HC，Fischer M，et al．The incidence of acute encephalitis syndrome in Western industrialized and tropical countries［J］．Virol J，2008，5：134．

［3］Kulkarni MA，Lecocq AC，Artsob H，et al．Epidemiology and aetiology of encephalitis in Canada，1994-2008：a case for undiagnosed arboviral agents［J］．Epidemiol Infect，2013，141（11）：2 243-2 255．

［4］Huppatz C．Durrheim DN，Levi C，et al．Etiology of encephalitis in Australia，1990-2007［J］．Emerg Infect Dis，2009，15（9）：1 359-1 365．

［5］Granerod J，Tam CC，Crowcroft NS，et al．Challenge of the unknown：a systematic review of acute encephalitis in non-outbreak situations［J］．Neurology，2010，75（10）：924-932．

［6］Zamora MR．DNA viruses（CMV，EBV，and the herpesviruses）［J］．Semin Respir Crit Care Med，2011，32（4）：454-470．

［7］申旭霞，趙超芬，宋楊．一步檢測法梅毒抗體ELISA 試劑的鉤狀效應分析［J］．檢驗醫學與臨床，2009，6（1）：46．

［8］門守山．血液檢測中鉤狀效應探討［J］．臨床輸血與檢測，2008，10（4）：310-312．

［9］Mutton，Guiver M．Laboratory techniques for human viral encephalitis diagnosis［J］．Infect Disord Drug Targets，2011，11（3）：265-269．

［10］Bustin SA．Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR（RT-PCR）：trend and problems［J］．Mol Endocrinol，2002，29（1）：23-29．

［11］Utley TF，Ogden JA，Gibb A，et al．The long-term neuropsychological outcome of herpes simplex encephalitis in a series of unselected survivors［J］．Neuropsychiatry Neuropsychol Behav Neurol，1997，10（3）：180-189．

［12］McGrath N，Anderson NE，Croxson MC，Powell KF．Herpes simplex encephalitis treated with acyclovir：diagnosis and long term outcome［J］．J Neurol Neurosurg Psychiatry，1997，63：321-326．

［13］McArthur JC．HIV dementia：an evolving disease．J Neuroimmunol．2004；157：3-10．doi：10．1016／［J］．jneuroim．2004，157（1-2）：3-10．

［14］Ito Y，Kimura H，Yabuta Y，Ando Y，Murakami T，Shiomi M，Morishima T．Exacerbation of herpes simplex encephalitis after successful treatment with acyclovir［J］．Clin Infect Dis，2000，30（1）：185-187．

［15］Chaudhuri A，Kennedy P．Diagnosis and treatment of viral encephalitis［J］．Postgrad Med J，2002，78（924）：575-583．

［16］Whitley R，Gnann J．Viral encephalitis：familiar infections and emerging pathogens［J］．Lancet．2002，359（9305）：507-513．