全自動在線渦流固相萃取—液相色譜—串聯質譜法直接分析血清中4種雄激素

郭峰等

摘 要 建立了一種全自動在線渦流固相萃取液相色譜質譜聯用直接分析血清中4種雄激素的分析方法。50 μL血清樣品經高速離心后，可直接用渦流固相萃取柱在線富集和分析。

對乙腈水、甲醇水兩種流動相進行了比較，結果表明，使用乙腈水流動相，目標化合物峰型較好。在等度洗脫條件下目標物的色譜峰相互重疊，為了得到較好的分離效果，采用梯度洗脫條件。由于目標物在反洗脫的過程中樣品基質中的有機組分可能被同時轉入分析柱，初始的液相梯度設置為相對較低的有機相比例（40% ACN）。

3.3 在線固相萃取條件優化

在本研究組已建立的代謝類固醇在線分析方法

3.7 樣品分析結果

將本方法應用于實際血清樣品的分析。為了進一步驗證方法的準確性，分別選擇10和100 μg/L兩個不同濃度水平進行加標回收率實驗，回收率在58.2%～127.6%之間，相對標準偏差在2.9%～14.1%之間（n=5），可以滿足實際樣品分析的需要。樣品中4種目標物濃度及加標回收率如表3所示，圖2為加標血清樣品分析色譜圖。結果表明， 本方法實現了提取、分離、檢測和柱子再生全過程在線自動完成，耗時少，精密度高，適用于血清中雄性激素的檢測。

References

1 KulleA E， Riepe F G， Melchior D， Hiort O， Holterhus P M. J. Clin. Endocr. Metab.， 2010， 95（5）： 2399-2409

2 Zofkova I， ZajickovaK， Hill M. J. Endocrinol. Invest.， 2004， 27（5）： 442-444

3 ClarkA S， HendersonL P. Neurosci. Biobehav. Rev.， 2003， 27（5）： 413-436

4 Konieczna L， Plenis A， Oledzka I， Kowalski P， Baczek T. Talanta， 2011， 83（3）： 804-814

5 Schanzer W. Clin. Chem.， 1996， 42（7）： 1001-1020

6 Imamoto T， Utsumi T， Sazuka T， Yanagisawa M， Yano M， Sakamoto S， Kawamura K， Kamiya N， Nihei N， Suzuki H， Ichikawa T. J. Sex Med.， 2013， 10： 206-206

7 Soeborg T， Frederiksen H， Fruekilde P， Johannsen T H， Juul A， Andersson A M. Clin. Chim. Acta， 2013， 419： 95-101

8 Hoffmann P， Hartmann M F， Remer T， Zimmer K P， Wudy S A. Steroids， 2010， 75（13-14）： 1067-1074

9 Erdogan E， Kushnir M M， Yue B， Blamires T L， Roberts W L， Meikle A W， Rockwood A L. Clin. Chem.， 2009， 55（6）： 184-184

10 Rauh M. J. Steroid Biochem.， 2010， 121（35）： 520-527

11 Guo F， Liu Q， Qu G B， Song S J， Sun J T， Shi J B， Jiang G B. J. Chromatogr. A， 2013， 1281： 9-18

12 Guo F， Shao J， Liu Q， Shi J B， Jiang G B. Talanta， 2014， 125： 432-438

13 Couchman L. Biomed. Chromatogr.， 2012， 26（8）： 892-905

Fully Automated Determination of Four Androgenic Hormones in

Serum by Online Turbulent Flow Solid Phase Extraction Coupled

with Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry

GUO Feng1，2， SHI JianBo*1， JIANG GuiBin1

1（State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology， Research Center for EcoEnvironmental Sciences，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100085， China）

2（National Research Center for Geoanalysis， Beijing 100037， China）

Abstract A novel method was developed for the direct analysis of testosterone， androstenedione， methyltestosterone and methenolone in serum samples by fully automated online turbulent flow solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. An aliquot of 50 μL serum sample was preconcentrated directly on a Turboflow SPE column after centrifugation. Turboflow SPE C18P could be used to remove serum matrix effectively. The optimum loading flow rate and elution time were 4.0 mL/min and 1.0 min， respectively. The linearity ranges were from 1.0 μg/L to 100.0 μg/L for four target compounds. The method limits of detection （LODs） were in the range of 0.2-0.3 μg/L. The relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.9% to 14.1% （n=5）. The time for one sample analysis including extraction， separation and determination was 32 min. The proposed method has been successfully applied for the analysis of serum samples.

Keywords Androgenic hormones； Serum； Online solid phase extraction； Liquid chromatography； Mass spectrometry

（Received 22 August 2014； accepted 22 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21377155） and the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences （No. XDB14010400）

摘 要 建立了一種全自動在線渦流固相萃取液相色譜質譜聯用直接分析血清中4種雄激素的分析方法。50 μL血清樣品經高速離心后，可直接用渦流固相萃取柱在線富集和分析。

對乙腈水、甲醇水兩種流動相進行了比較，結果表明，使用乙腈水流動相，目標化合物峰型較好。在等度洗脫條件下目標物的色譜峰相互重疊，為了得到較好的分離效果，采用梯度洗脫條件。由于目標物在反洗脫的過程中樣品基質中的有機組分可能被同時轉入分析柱，初始的液相梯度設置為相對較低的有機相比例（40% ACN）。

3.3 在線固相萃取條件優化

在本研究組已建立的代謝類固醇在線分析方法

3.7 樣品分析結果

將本方法應用于實際血清樣品的分析。為了進一步驗證方法的準確性，分別選擇10和100 μg/L兩個不同濃度水平進行加標回收率實驗，回收率在58.2%～127.6%之間，相對標準偏差在2.9%～14.1%之間（n=5），可以滿足實際樣品分析的需要。樣品中4種目標物濃度及加標回收率如表3所示，圖2為加標血清樣品分析色譜圖。結果表明， 本方法實現了提取、分離、檢測和柱子再生全過程在線自動完成，耗時少，精密度高，適用于血清中雄性激素的檢測。

References

1 KulleA E， Riepe F G， Melchior D， Hiort O， Holterhus P M. J. Clin. Endocr. Metab.， 2010， 95（5）： 2399-2409

2 Zofkova I， ZajickovaK， Hill M. J. Endocrinol. Invest.， 2004， 27（5）： 442-444

3 ClarkA S， HendersonL P. Neurosci. Biobehav. Rev.， 2003， 27（5）： 413-436

4 Konieczna L， Plenis A， Oledzka I， Kowalski P， Baczek T. Talanta， 2011， 83（3）： 804-814

5 Schanzer W. Clin. Chem.， 1996， 42（7）： 1001-1020

6 Imamoto T， Utsumi T， Sazuka T， Yanagisawa M， Yano M， Sakamoto S， Kawamura K， Kamiya N， Nihei N， Suzuki H， Ichikawa T. J. Sex Med.， 2013， 10： 206-206

7 Soeborg T， Frederiksen H， Fruekilde P， Johannsen T H， Juul A， Andersson A M. Clin. Chim. Acta， 2013， 419： 95-101

8 Hoffmann P， Hartmann M F， Remer T， Zimmer K P， Wudy S A. Steroids， 2010， 75（13-14）： 1067-1074

9 Erdogan E， Kushnir M M， Yue B， Blamires T L， Roberts W L， Meikle A W， Rockwood A L. Clin. Chem.， 2009， 55（6）： 184-184

10 Rauh M. J. Steroid Biochem.， 2010， 121（35）： 520-527

11 Guo F， Liu Q， Qu G B， Song S J， Sun J T， Shi J B， Jiang G B. J. Chromatogr. A， 2013， 1281： 9-18

12 Guo F， Shao J， Liu Q， Shi J B， Jiang G B. Talanta， 2014， 125： 432-438

13 Couchman L. Biomed. Chromatogr.， 2012， 26（8）： 892-905

Fully Automated Determination of Four Androgenic Hormones in

Serum by Online Turbulent Flow Solid Phase Extraction Coupled

with Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry

GUO Feng1，2， SHI JianBo*1， JIANG GuiBin1

1（State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology， Research Center for EcoEnvironmental Sciences，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100085， China）

2（National Research Center for Geoanalysis， Beijing 100037， China）

Abstract A novel method was developed for the direct analysis of testosterone， androstenedione， methyltestosterone and methenolone in serum samples by fully automated online turbulent flow solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. An aliquot of 50 μL serum sample was preconcentrated directly on a Turboflow SPE column after centrifugation. Turboflow SPE C18P could be used to remove serum matrix effectively. The optimum loading flow rate and elution time were 4.0 mL/min and 1.0 min， respectively. The linearity ranges were from 1.0 μg/L to 100.0 μg/L for four target compounds. The method limits of detection （LODs） were in the range of 0.2-0.3 μg/L. The relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.9% to 14.1% （n=5）. The time for one sample analysis including extraction， separation and determination was 32 min. The proposed method has been successfully applied for the analysis of serum samples.

Keywords Androgenic hormones； Serum； Online solid phase extraction； Liquid chromatography； Mass spectrometry

（Received 22 August 2014； accepted 22 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21377155） and the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences （No. XDB14010400）

摘 要 建立了一種全自動在線渦流固相萃取液相色譜質譜聯用直接分析血清中4種雄激素的分析方法。50 μL血清樣品經高速離心后，可直接用渦流固相萃取柱在線富集和分析。

對乙腈水、甲醇水兩種流動相進行了比較，結果表明，使用乙腈水流動相，目標化合物峰型較好。在等度洗脫條件下目標物的色譜峰相互重疊，為了得到較好的分離效果，采用梯度洗脫條件。由于目標物在反洗脫的過程中樣品基質中的有機組分可能被同時轉入分析柱，初始的液相梯度設置為相對較低的有機相比例（40% ACN）。

3.3 在線固相萃取條件優化

在本研究組已建立的代謝類固醇在線分析方法

3.7 樣品分析結果

將本方法應用于實際血清樣品的分析。為了進一步驗證方法的準確性，分別選擇10和100 μg/L兩個不同濃度水平進行加標回收率實驗，回收率在58.2%～127.6%之間，相對標準偏差在2.9%～14.1%之間（n=5），可以滿足實際樣品分析的需要。樣品中4種目標物濃度及加標回收率如表3所示，圖2為加標血清樣品分析色譜圖。結果表明， 本方法實現了提取、分離、檢測和柱子再生全過程在線自動完成，耗時少，精密度高，適用于血清中雄性激素的檢測。

References

1 KulleA E， Riepe F G， Melchior D， Hiort O， Holterhus P M. J. Clin. Endocr. Metab.， 2010， 95（5）： 2399-2409

2 Zofkova I， ZajickovaK， Hill M. J. Endocrinol. Invest.， 2004， 27（5）： 442-444

3 ClarkA S， HendersonL P. Neurosci. Biobehav. Rev.， 2003， 27（5）： 413-436

4 Konieczna L， Plenis A， Oledzka I， Kowalski P， Baczek T. Talanta， 2011， 83（3）： 804-814

5 Schanzer W. Clin. Chem.， 1996， 42（7）： 1001-1020

6 Imamoto T， Utsumi T， Sazuka T， Yanagisawa M， Yano M， Sakamoto S， Kawamura K， Kamiya N， Nihei N， Suzuki H， Ichikawa T. J. Sex Med.， 2013， 10： 206-206

7 Soeborg T， Frederiksen H， Fruekilde P， Johannsen T H， Juul A， Andersson A M. Clin. Chim. Acta， 2013， 419： 95-101

8 Hoffmann P， Hartmann M F， Remer T， Zimmer K P， Wudy S A. Steroids， 2010， 75（13-14）： 1067-1074

9 Erdogan E， Kushnir M M， Yue B， Blamires T L， Roberts W L， Meikle A W， Rockwood A L. Clin. Chem.， 2009， 55（6）： 184-184

10 Rauh M. J. Steroid Biochem.， 2010， 121（35）： 520-527

11 Guo F， Liu Q， Qu G B， Song S J， Sun J T， Shi J B， Jiang G B. J. Chromatogr. A， 2013， 1281： 9-18

12 Guo F， Shao J， Liu Q， Shi J B， Jiang G B. Talanta， 2014， 125： 432-438

13 Couchman L. Biomed. Chromatogr.， 2012， 26（8）： 892-905

Fully Automated Determination of Four Androgenic Hormones in

Serum by Online Turbulent Flow Solid Phase Extraction Coupled

with Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry

GUO Feng1，2， SHI JianBo*1， JIANG GuiBin1

1（State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology， Research Center for EcoEnvironmental Sciences，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100085， China）

2（National Research Center for Geoanalysis， Beijing 100037， China）

Abstract A novel method was developed for the direct analysis of testosterone， androstenedione， methyltestosterone and methenolone in serum samples by fully automated online turbulent flow solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. An aliquot of 50 μL serum sample was preconcentrated directly on a Turboflow SPE column after centrifugation. Turboflow SPE C18P could be used to remove serum matrix effectively. The optimum loading flow rate and elution time were 4.0 mL/min and 1.0 min， respectively. The linearity ranges were from 1.0 μg/L to 100.0 μg/L for four target compounds. The method limits of detection （LODs） were in the range of 0.2-0.3 μg/L. The relative standard deviations （RSDs） ranged from 2.9% to 14.1% （n=5）. The time for one sample analysis including extraction， separation and determination was 32 min. The proposed method has been successfully applied for the analysis of serum samples.

Keywords Androgenic hormones； Serum； Online solid phase extraction； Liquid chromatography； Mass spectrometry

（Received 22 August 2014； accepted 22 October 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21377155） and the Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences （No. XDB14010400）