一種質粒DNA標準物質的定值數據統計及不確定度評定

許 麗，梁 文，李 妍，任淑貞，丁 敏，劉 剛

（上海市計量測試技術研究院，上海 201203）

0 引 言

質粒分子標準物質是一種含有外源目的基因片段的重組分子[1]，具有制備成本低，易于富集，穩定性好的優點。由于微生物檢測領域部分陽性樣品難以獲得，帶有特異性目標檢測基因的質粒分子標準物質，成為解決病原微生物分子生物學檢測量值溯源問題的途徑之一，廣泛應用于各種PCR檢測領域[2]。本文研制的阪崎腸桿菌檢測質粒DNA標準物質在PCR定性定量檢測中可以作為陽性對照或者定量標準，解決了相關分子生物學檢測實驗室陽性樣品缺乏的難題。本文主要報道了該標準物質在定值過程中的數據統計和不確定評定過程。

根據JJF 1343——2012《標準物質定值的通用原則及統計學原理》[3]的要求，我們選擇第三類定值方案：使用一種或多種已經證明準確性的方法，由多個實驗室合作定值。具體的定值方法分為兩種：

1）紫外分光光度法（UV）。核酸分子含有嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵，其紫外可見吸收光譜在260nm附近有一強的吸收峰。針對雙鏈DNA，樣品濃度和吸光值之間有以下關系：雙鏈DNA樣品濃度（ng/μL）=OD260×核酸稀釋倍數×50，其中 OD260為核酸在260nm處的吸光值[4]。

2）高分辨電感耦合等離子體質譜（HR-ICP-MS）。由于DNA分子結構可知，對于序列已知的DNA分子，DNA分子中磷元素的含量和DNA分子的數量有固定線性關系。在DNA中，每個堿基對應一個磷原子，分子中磷元素含量（質量分數）可由下式計算：磷元素含量（P%）=堿基數×磷的原子量÷DNA分子量。因此可以通過測定DNA樣品中的磷元素的含量換算出DNA的濃度，DNA濃度可由下式計算：DNA濃度=實驗測定的磷元素含量÷DNA分子含磷量（P%）[5]。

在質粒DNA標準物質的研制過程中，一共有9家實驗室參與了合作定值，本文報道了數據統計過程，并對實驗結果的影響因素進行了分析，對測量結果的不確定度進行了評定。

1 實驗部分

1.1 主要定值檢測儀器與試劑

微量核酸蛋白定量儀（nanodrop ND-2000）；紫外分光光度計（Lambda950）；電感耦合等離子體發射質譜儀（Thermo Fisher Element2）。

重鉻酸鉀溶液標準物質（GBW（E）081609，標準值0.099 9 mol/L，相對不確定度為0.2%）；磷標準溶液（NIST，SRM3139a，10.016±0.033mg/L）等。

1.2 定值過程

一共有8家實驗室使用UV法對質粒DNA標準物質進行定值，其中有1家實驗室采用HR-ICPMS法。每家實驗室分別對質粒DNA標準物質，平行測定8次，進行定值分析。

1.2.1 UV測定質粒DNA標準物質

實驗步驟：1）用TE緩沖液作為空白溶液，使紫外分光光度計校正為零點；2）取適量DNA（根據儀器的需要）進行檢測，記錄儀器讀數，濃度單位為ng/μL；3）每個樣品檢測8次，記錄實驗結果。

1.2.2 HR-ICP-MS測定質粒DNA標準物質

在采用元素分析法對DNA定量之前，首先要確定質粒DNA具有足夠的純度，繼而需要根據質粒DNA標準物質的堿基組成和序列長度，計算其中磷元素的含量，這樣就能估算適合的稀釋倍數。在本實驗中，我們最終將實驗室研制的質粒DNA標準物質稀釋2000倍，從而落在HR-ICP-MS最優的P元素檢測范圍[6-7]。 以磷標準溶液（NIST，SRM3139a）制備1～5 ng/mL范圍標準曲線，對質粒DNA標準物質進行定量檢測。經過一系列的研究和優化，最終確定HR-ICP-MS主要技術參數：冷卻氣流量16.86L/min，霧化氣流量為1.123L/min，輔助氣流量為0.99L/min，功率1350W。每個樣品檢測8次，并記錄實驗結果。

1.3 定值數據統計

在得到測定結果后，根據統計方法要求[3，8]對測定結果進行統計處理。通過統計學評估的數據如表1所示。

表1 質粒DNA標準物質pXL06定值結果1）

2 不確定度的評定

質粒DNA標準物質的定值過程帶來的不確定度uchar包括數據統計引入的不確定度uchar1和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度uchar2。

2.1 數據統計引入的不確定度uchar1

質粒DNA標準物質由數據統計引入的不確定度即是使用兩種方法，由9家實驗室合作定值數據統計引入的不確定度。由于確認的特性值恰好是各組平均值的平均值（即各組數據不存在平均值和標準偏差的不一致性），即如下式所示：

式中：——總平均值；

Yi——各組數據的平均值；

p——實驗室數目。

那么，與平均值的平均值相關的合成標準不確定度的基礎是標準偏差，可由下式獲得：

合成標準不確定度為

相對不確定度為

2.2 定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度uchar2

2.2.1 UV方法測量影響因素引入的不確定度

用UV對質粒標準物質進行定值，檢測時儀器利用液體的表面張力特性控制樣品池中的樣品量，因此測量影響因素引入的不確定度即為儀器本身引入的不確定度。

本文用重鉻酸鉀溶液標準物質（GBW（E）081609）考察了紫外分光光度計在257 nm處吸光值的準確性，其中相對標準偏差為0.02%，即該相對不確定度為 0.02%（見表 2）。

表2 吸光值準確性考察

2.2.2 HR-ICP-MS方法測量影響因素引入的不確定度

1）數學模型的建立

充分考慮樣品檢測過程中的各種影響因素，建立不確定評估模型如下：

式中：c——質粒DNA標準物質濃度；

cs——由標準曲線求得樣品液中P含量；

Vs——檢測時樣品最終體積；

V——吸取質粒DNA標準物質原液體積；

9.6%——質粒DNA分子中P元素含量（由堿基數×磷的原子量÷DNA分子量計算得出）。

其中質粒DNA標準物質濃度標準不確定度用uc（c）表示，由標準曲線計算的樣品液中P含量標準不確定度用uc（cs）表示，樣品溶液制備體積不確定度用uc（Vs）表示，吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度用uc（V）表示。由此得到的相對標準不確定度傳播率為

2）cs不確定度的計算

cs的不確定度由兩部分組成：當由5種P標準溶液的質量濃度（1，2，3，4，5 ng/mL）與 P 標準物質產生的信號強度擬合的直線求得cs時測量所產生的不確定度；由標準貯備液配制成5種質量濃度標準溶液時所產生的對cs測量所產生的不確定度。

①由擬合曲線求得cs時所產生的不確定度uc，1（cs）

用HR-ICP-MS測定質粒標準物質中的P含量，利用 P標準物質（NIST，SRM3139a）配制 5種標準 溶 液 ，P 質 量 濃 度 分 別 為 1，2，3，4，5 ng/mL，用HR-ICP-MS對上述5種P標準溶液進行測定，結果見表3。

表3 各質量濃度下P標準物質質譜信號豐度測量值

根據測定結果建立標準曲線，經過線性擬合得出：

式中：A——質譜信號豐度；

cm——溶液中P元素的含量。

對cs進行8次測量，通過曲線方程求得cs=3.57ng/mL，則cs的標準不確定度[9-10]為

式中B1=3514.8；

P=8（對cs進行 8 次測量），n=5（共 5 次測量）；

將上述各值代入式（8）得到：

②配制P標準工作溶液的不確定度uc（c5）

以5ng/mL標準工作溶液為例闡述不確定度的大小，其配制步驟為：用最大量程為1 mL的移液器移取 1mL P 標準溶液（10.016±0.33）mg/L，定容至10 mL，配成1 mg/L的標準溶液，稀釋因子為f1=10；用上述1mL的移液器移取1mg/L P標準溶液1mL，定容至10mL，配成0.1mg/L的標準溶液，稀釋因子為f2=10；用上述1mL的移液器移取0.1mg/L P標準溶液1 mL，定容至10 mL，配成0.01 mg/L的標準溶液，稀釋因子f3=10；用最大量程為5mL移液器移取0.01mg/L的標準溶液5mL，定容至10mL，配成5ng/mL標準工作溶液，稀釋因子f4=2，則：

所以：

（B）1mL移液器移取1mL時引入的不確定度uc（V1）

（C）10mL 容量瓶引入的不確定度 uc（V10）

（D）最大量程為5 mL的移液器移取5 mL時引入的不確定度 uc（V5）

所以：

將上述值代入式（9），則：

則質粒DNA標準物質cs的相對不確定度合成為

3）樣品溶液制備體積 Vs的不確定度 uc（Vs）

樣品溶液制備過程如下：取5μL質粒標準物質原液，定容至10mL，則稀釋倍數為2000倍。

①由10 μL移液器移取5 μL時產生的不確定度 uc（V0.005）

（B）移液器和溶液的溫度與校正時溫度不同引起的不確定度 uc，2（V1）：實驗室溫度控制在（20±3）℃（置信水平為95%），水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，因此產生的體積變化為±3×5×2.1×10-4=±0.0032μL，按照均勻分布轉化：

則：

②10mL容量瓶引入的不確定度uc（V10）

所以，樣品溶液體積Vs引入的相對不確定度合成為

4）吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度uc（V）

吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度：

因此將式（10）、式（11）、式（12）代入式（6），得到HR-ICP-MS檢測質粒DNA標準物質的相對標準不確定度為：

2.2.3 兩種方法測量過程影響因素引入的合成相對不確定度

將紫外方法和HR-ICP-MS方法測量過程影響因素引入的相對不確定度進行合成：

2.3 質粒DNA標準物質的定值過程引入的不確定度uchar總結

最終，將定值過程引入的相對不確定度合成：

合成不確定度 uchar=75.1×1.4%=1.05ng/μL。 取包含因子 k=2，則擴展不確定度 U=2×1.05=2.1 ng/μL，相對擴展不確定度為2.8%（k=2）。因此，測得的質粒DNA 標準物質的濃度表示為：（75.1±2.1）ng/μL（k=2）。

表4 各相對不確定度分量計算結果

3 結束語

本文應用UV和HR-ICP-MS兩種方法，對質粒DNA標準物質進行定值，為了得到更準確的實驗結果，并且結果可以溯源至國際單位。本文以一種質粒DNA為例，綜合考慮了實驗過程中影響結果的各種因素，探討了此類定值方法過程中的不確定來源，最終對不確定度的評定方法和步驟進行了分析。

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