龍眼果肉發酵紅茶菌飲料*

宋清鵬，胡卓炎，趙雷，周沫霖，余小林

(華南農業大學食品學院，廣東廣州，510642)

紅茶菌，俗稱“海寶”，在我國具有悠久的歷史，是由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等幾種微生物組成的共生體。以茶糖水為培養液，利用紅茶菌發酵的飲料是一種很好的保健飲品。紅茶菌飲料具有幫助消化、清理腸胃、保肝［1］等保健作用。國內外研究表明:紅茶菌飲料也具有解毒、抗癌和增強人體免疫力的功效［2-4］。紅茶菌飲料作為健康、安全的飲品，越來越受到人們的歡迎。紅茶菌飲料所含有的D-葡糖糖二酸1，4-內酯(D-glucose acid 2-1，4-lactone，DSL)和D-葡萄糖二酸已被廣泛地研究。作為抗癌因子，DSL能抑制與癌癥相關的β-葡糖醛酸糖苷酶［5］。而在一定條件下DSL能與D-葡萄糖二酸進行轉化［6］。因此，研究這兩種功能性物質具有一定的意義。

龍眼香甜美味，潤滑可口，是我國南方很受歡迎的水果。龍眼果肉有很高的營養價值，具有壯陽益氣、補益心脾、潤膚美容等多種功效［7-8］。龍眼含糖量約為14%-18%之間［9］，可為紅茶菌的生長提供部分碳源和氮源。紅茶菌結合龍眼果肉發酵可以賦予飲料新的風味，增加其營養成分。龍眼干含糖量高達30%［10］。從口感方面考慮，高糖龍眼干具有粘度大、多食則膩等缺點;從健康方面看，高糖食品易導致肥胖、高血脂，誘發心臟病、糖尿病等疾病。而經發酵后的龍眼果肉可以進一步加工成具有獨特風味、有益健康的低糖龍眼干。這有助于充分利用原料，降低生產成本，提高經濟效益。研究不同溫度、初始糖度、接種量等因素對龍眼紅茶菌飲料發酵的影響，進行工藝條件優化，對進一步的研究具有現實指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

LC-10AT高效液相色譜，日本島津公司;冷凍離心機，德國ZENTRIFUGEN公司;SB-Aq色譜柱，美國安捷倫公司;UV-2550PC型島津紫外可見掃描儀分光光度計，日本島津公司;SKP-01電熱恒溫箱，湖北省黃石市醫療器械廠;HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司;BS110S分析天平，德國Sartorius公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

100 mL 0.7%［11］的綠茶水+50 g龍眼果肉→接種→調糖度→8層紗布封口→恒溫箱培養→定期測量指標

1.3.2 指標測定

總酸:NaOH 滴定法［12］。

DSL和D-葡萄糖二酸:將發酵液以3500 r/min的速度離心15 min。取上清液，用流動相稀釋10倍，經22 μm水系濾膜過濾后進樣分析，高效液相色譜分析條件參照張紅等(2012)的方法［13］，色譜圖見圖1。

東安三村太小，有時玩不爽快，父親就帶我和堂妹去復興公園。最刺激的是高處君臨的激流勇進，只見堂妹手里捏緊門票，心情緊張地奔到欄桿口，等到欄桿的鐵鏈松開，她撲通一聲跳進船里，兩手橫握扶柄。父親站在欄桿外吩咐“要當心”時，工作人員已按住開關，我們跳上船，往矮凳上一坐，即起航了。我們握著兩只扶柄，按順序坐好，一顛一簸，有露牙說笑的，有張嘴開口的，溪水合著節節敲打的拍子，在左右都是綠樹叢林的畫面里一顛一簸地流向遠處去了。堂妹走出來，樂個不停：“這游戲不夠驚險，我們玩過山車去，翻的轉的都有，年輕人玩得很多，我以前嘗試過。”那時，我并不知道公園里有這么稀奇的游戲，那可都是我往常不敢玩的。

1.3.3 單因素試驗設計

圖1 標準品(a)和樣品(b)的DSL(1)和D-葡萄糖二酸(2)色譜圖Fig.1 Chromatogram of DSL(1)and D-glucaric acid(2)of standards(a)and samples(b)

考察發酵溫度、初始可溶性固形物(TSS:total soluble solid)和接種量3個因素條件對發酵液總酸含量的影響。單因素試驗設計表見表1。由于總酸與功能物質D-葡糖糖二酸1，4-內酯和D-葡萄糖二酸極顯著相關［14］。因此，可以通過總酸快速判斷功能性物質的含量。圖5中的預測曲線也驗證了功能性物質的最優條件也在單因素實驗設計的范圍之內。因此單因素試驗探討發酵條件對發酵液總酸含量的影響。

表1 單因素試驗設計Table 1 Design of single factor

1.3.4 響應面實驗設計

采用3因素3水平的Box-Behnken實驗設計，以溫度(X1)、TSS(X2)和接種量(X3)3個因素為變量，以發酵液總酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)為響應值，采用期望函數途徑優化發酵工藝參數，得出龍眼果肉發酵紅茶菌飲料的優化條件，并進行驗證實驗。表2為實驗因素和水平。

表2 Box-Behnken實驗因素和水平Table 2 factor and level of Box-Behnken experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同的發酵條件對發酵液總酸度的影響

溫度是影響微生物生長和發酵的最重要因素之一。在一定的范圍內，微生物的生長代謝隨著溫度的升高而增加。但是當到達一定溫度時，就會開始不利于微生物的代謝生長。繼續升高溫度，細胞可能不適于生長甚至死亡。將樣品分別放置于25、30、35、40℃的恒溫條件下進行發酵，定期測量酸度，結果見圖2。

圖2 溫度對發酵液總酸的影響Fig.2 Effect of temperature on total acid of fermentation broth

由圖2可以看出，發酵液總酸含量隨著發酵時間的延長不斷增大，且在第6天酸度達到最大值，而后趨于穩定。30℃下產酸最多(28.01 g/L)，其次是35℃、25℃和40℃。溫度較低時，隨著溫度的升高，微生物細胞內的酶活性提高，反應加快;當溫度過高時，細胞內酶失活，不利于微生物生長，從而產酸較少。

2.1.2 初始可溶性固形物含量(TSS)對總酸的影響初始可溶性固形物(TSS)對于紅茶菌的影響是兩方面的。一方面，紅茶菌的生長需要足夠的碳源和氮源等，而糖就是其中之一;另一方面，TSS濃度過大，即培養液的滲透壓過大，微生物細胞脫水引起質壁分離，不利于紅茶菌生長與發酵［15］。因此，紅茶菌發酵需要合適的TSS，過高或者過低都不利于發酵。由圖3可以看出，初始TSS為14°Brix時，酸產量最高(35.87 g/L)，其次為 10、18°和 6°Brix，且在第 6 天，總酸就達到最大值，而后趨于不變。

圖3 初始可溶性固形物含量(TSS)對發酵液總酸的影響Fig.3 Effect of initial total soluble solid(TSS)on total acid of fermentation broth

2.1.3 接種量對總酸的影響

接種量對紅茶菌發酵有重要影響。生產上經常通過調整接種量來提高生產效率和經濟效益。大量接種紅茶菌有利于縮短發酵周期，提高產量。但是，接種量過大，發酵液中的營養物質被主要用于醋酸菌的增殖，并且有大量的代謝物質產生，導致細胞過早發生老化、自溶等現象［16-17］。因此，只有合適的接種量才能保證酸產量和經濟效益。由圖4可知，在第6天總酸達到最大值。隨著接種量的增加，總酸越大。但當接種量增加到18%時，酸產量減少。在接種量為14%時，酸產量最高(30.35 g/L)。

圖4 接種量對發酵液總酸的影響Fig.4 Effect of inoculation quantity on total acid of fermentation broth

2.2 期望函數途徑優化發酵工藝參數

總酸的產量對于實際生產極其重要。而作為紅茶菌中的功能性物質，DSL和D-葡萄糖二酸也是需要考量的重要指標。因此，在利用Box-Behnken實驗設計進行工藝優化時，將總酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)作為響應值。按照表2進行實驗，得出結果(表3)。

表3 Box-Behnken實驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface analysis

圖5是通過SAS V8軟件作響應面處理得來的單因素預測曲線。在實驗設計的范圍內，隨著各個因素水平的增大，Y1(總酸)先增大后減小。這與本研究的單因素實驗結果一致(圖2-4)。而Y2(DSL)和Y3(D-葡萄糖二酸)的變化趨勢與總酸一致，這也說明了Y2和Y3兩種功能性物質的最佳發酵條件在本實驗設計范圍之內。

圖5 響應值對不同單因素的預測曲線Fig.5 Prediction profile of responses to different factors

2.2.1 總酸

通過SAS V8軟件進行二次回歸擬合，得出了Y1(總酸)的二次回歸方程為:

表4中對Y1(總酸)的方差分析結果表明，該模型的Prob＞F值＜0.01。這說明該模型是極顯著的。而失擬項(＞0.05)不顯著。與此同時，該模型的相關系數為99.25%，遠遠大于90%。這說明模型的相關度很好，可以很好地預測結果。模型中P(X1)和P(X3)均小于0.05，而P(X2)大于0.05，這說明X1(溫度)和X3(接種量)對Y1(總酸)顯著，而X2(TSS)則對總酸不顯著。X1和X3之間的交互作用較顯著，其他交互作用不顯著。F值能在相同自由度的情況下代表某個因素對于響應值的重要性。從表5可以看出，F(X1)＞F(X3)＞F(X2)。因此，各因素對度龍眼果肉發酵紅茶菌飲料的總酸影響程度大小順序為:X1(溫度)＞X3(接種量)＞X2(TSS)。

2.2.2 D-葡糖糖二酸 1，4-內酯(DSL)

同理分析得到Y2(DSL)的二次回歸方程:

該模型的Prob＞F值＜0.01，所以該模型是極顯著的;失擬項不顯著;而決定系數R2=99.02%，這說明該模型的相關度很好，能夠很好地反應真實數據。X1、X2和X2的P值均小于0.05。因此，各因素對Y2(DSL)均顯著。X1、X3之間的交互作用顯著(圖6(a))，而其他單因素之間的交互作用不顯著。隨著X1(溫度)和X3(接種量)同時增大，Y2(DSL)的含量逐漸增加到最大值，而后又慢慢變小。分析F值，可以得到，各因素對DSL合成量的影響大小順序為 X2(TSS)，X3(接種量)，X1(溫度)。這是因為 DSL是由D-葡萄糖二酸轉化而來。而D-葡萄糖二酸來源于醋酸菌分解蔗糖后得到的葡萄糖［18］。因此，蔗糖的量(TSS)對DSL的合成量影響最大。

表4 各響應值的方差析表Table 4 ANOVA for different responses

2.2.3 D-葡萄糖二酸

分析得到Y3的二次回歸方程如下:

該模型極顯著，失擬項不顯著，說明模型擬合較好。決定系數R2=99.25%，即該模型相關度極好。同上分析表4，單因素X1(溫度)、X2(TSS)和X3(接種量)對Y3(D-葡萄糖二酸)均為顯著。與Y2模型中結果一致，3因素之間中只有X1、X3的交互作用顯著(圖6)。當X1(溫度)X3(接種量)均增大時，Y3(D-葡萄糖二酸)增大到最大值再逐漸變小。同時這也在某種程度上驗證了DSL和D-葡萄糖二酸之間有一定的關系。而事實研究也表明兩種功能性物質之間可以進行轉化［6］。各單因素 F值說明X2(TSS)對 Y3(D-葡萄糖二酸)的影響最大，其次是X3(接種量)和X1(溫度)。

2.2.4 最佳條件的篩選

圖6 溫度和接種量對DSL和D-葡萄糖二酸影響Fig.6 Effect of temperature andinoculation quantity on DSL and D-glucaric acid

利用SAS軟件進一步對數據分析計算，將Y2(DSL)作為優先考慮的響應值，得出一系列總酸的較優發酵條件。在這些條件中篩選出比較適合響應值Y1(總酸)和Y3(D-葡萄糖二酸)的較優的水平條件:X1(溫度)為 -0.07，X2(TSS)為 0.09，X3(接種量)為0.15。轉換后的實際條件X1(溫度)為29.6℃，X2(TSS)為14.7°Brix，X3(接種量)為14.1%。依此條件進行實驗，測得發酵液的總酸為26.87 g/L，DSL為4.51 g/L，D-葡萄糖二酸為18.01 g/L(表5)。T檢驗結果表明，各項指標的實驗值與預測值無顯著性差異。這進一步說明模型能夠準確地預測結果。

表5 優化條件下的實驗結果Table 5 results under optimal condition of fermentation

3 結論與展望

(1)利用龍眼果肉結合紅茶菌進行發酵的最佳條件為:溫度29.6℃，初始可溶性固形物為14.7°Brix，接種量為14.1%，發酵時間6d。依此條件進行發酵，所得發酵液總酸含量為26.87 g/L，DSL為4.51 g/L，D-葡萄糖二酸為 18.01 g/L。

(2)紅茶菌的發酵賦予了龍眼果肉特殊的風味和功能性成分。經發酵后的龍眼果肉可以進一步加工成有益健康的低糖龍眼干。這樣可以高效利用原料，節約成本，提高經濟效益，具有現實的生產意義。

［1］ Semantee Bhattacharya a，Ratan Gachhui a，Parames C.Sil b，Hepatoprotective properties of kombucha tea against TBHP-induced oxidative stress via suppression of mitochondria dependent apoptosis［J］.Pathophysiology，2011，18:221-234

［2］ 吳薇，籍保平，田文禮.紅茶菌中D-葡萄糖二酸1，4內酯的氣相色譜檢測法［J］.食品科學，2005，26(1):168-169

［3］ Philippe J.Blanc.Characterization of the tea fungus metabolites［J］.Biotechnology Letters，1996，18(2):139-142.

［4］ Dong-Hyun Kim，Ho-Jung KANG，So-Hee Park et al.Characterization ofβ-glucosidase and β-glucuronidase of alkalotolerant intestinal bacteria［J］.Biol Pharm Bull，1994，17(3):423-426

［5］ Morse M A.Charaeterization of a glueuronide metabolite of 4-(methyl-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-batanone(NNK)and its dose-dependent exeretion in the urine of mice and rats［J］.Careinogenesis，1990，11(10):1 819-1 823

［6］ Zoltaszek R，Hanausek M，Kilianska ZM，et al.The biological role of D-glucaric acid and its derivatives:Potential use in medicine［J］.Postepy Postepy Hig Med Dosw，2008，9(62):451-462

［7］ 李升鋒，劉學銘，吳繼軍，等.龍眼果肉的研究與開發［J］. 福建果樹，2004，32(2):12-15.

［8］ 蔡長河，唐小浪，張愛玉，等.龍眼肉的食療價值及其開發利用前景［J］.食品科學，2002，23(8):328-330

［9］ 胡志群，李建光，王惠聰.不同龍眼品種果實品質和糖酸組分分析［J］.果樹學報，2006，23(4):568-571

［10］ 林啟訓.不同氣控干燥條件對龍眼肉干制品質量的影響及優化［J］.中國食品學報，2005，5(2):74-79

［11］ 李璇，陳義倫，黃麗梅，等.響應面法優化紅茶菌發酵工藝［J］.食品工業科技，2012(3):117-120

［12］ 黃曉鈺，劉鄰渭.食品化學與分析綜合實驗［M］.中國農業大學出版社，2009:138-154

［13］ 張紅，籍保平，吳薇.高效液相色譜法測定紅茶菌中的功能性因子［J］. 食品科技，2012，37(7):250-254

［14］ 王侃，甘旭華，唐欣昀等.營養成分對紅茶菌中D-葡糖糖二酸1，4-內酯和總酸含量的影響［J］.食品與發酵工業，2007，33(6):24-27.

［15］ 江漢湖.食品微生物［M］.北京:中國農業出版社，2005.186.

［16］ 李艷.發酵工業概論［M］.北京:中國輕工業出版社，1999，292-293.

［17］ 瑪麗娜.紅棗果醋的開發研究［D］.呼和浩特:內蒙古農業大學，2005，16-17.

［18］ Sievers M，Lanini C，Weber A.Microbiology and fermentation balance in kombucha beverage obtained from a tea fungus fermentation［J］.Systems Applied Microbiology，1995，18(8):590-594.