糟辣椒復合防腐劑配方的優化*

陳明珍，譚書明

1(貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽，550025)2(貴州大學生命科學學院，貴州貴陽，550025)

3(貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽，550025)

糟辣椒(Pickling Pepper)是湖南、貴州等地區備受歡迎的傳統調味品。糟辣椒在生產和儲藏過程中很容易受到污染變質，出現脹袋、脹罐的現象［1］，主要是糟辣椒中微生物的大量繁殖所致，包括細菌、霉菌、酵母菌［2-4］。因此，需要選擇合適方法來抑制微生物的生長繁殖，延長貨架期。

目前，國家允許在醬腌菜中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉、尼泊金酯鈉等幾種防腐劑［5-8］，傳統工藝中對糟辣椒的保藏技術主要是在糟辣椒發酵過程中添加單一的食品防腐劑:謝田［8］在糟辣椒發酵前分別加入脫氫醋酸鈉和苯甲酸鈉作對比實驗，發現均有一定的抑菌效果;李達［9］在糟辣椒發酵前加入殼聚糖對乳酸菌的生長繁殖有一定的抑制作用。由于不同防腐劑的抑菌原理各不相同，可想而知進行防腐劑的復配使用，效果要比單獨使用好［10］。因此，本實驗選擇脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀，對前期從糟辣椒中分離鑒定出的13種腐敗菌進行最低抑菌濃度(MIC)的測定和抑菌直徑實驗，確定每種防腐劑的用量范圍和典型菌的選擇。利用響應面方法對復合防腐劑配方進行優化，在不改變工廠傳統的糟辣椒發酵工藝的情況下，對已發酵好的糟辣椒進行保藏技術研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:從糟辣椒中分離出的13種腐敗菌，其中細菌10種、霉菌2種、酵母菌1種，分別標號為X1發酵乳桿菌、X2馬尿片球菌、X3耐酸乳桿菌、X4同型腐酒乳桿菌、X5消旋乳酸芽孢桿菌、X6植物乳桿菌、X7食糖乳桿菌、X8米酒乳桿菌、X9彎曲乳桿菌、X10嗜熱釋放芽孢桿菌、M1青霉屬、M2毛霉屬、J1酵母菌。防腐劑:脫氫醋酸鈉(食品級)，鄭州超群化工產品有限公司;苯甲酸鈉(食品級)，山東淵智化工有限公司;山梨酸鉀(食品級)，鄭州皇朝化工產品有限公司。培養基:營養瓊脂培養基，虎紅培養基，PDA培養基。

1.2 儀器和設備

超凈工作臺SW-CJ-IFD蘇州市華宇凈化設備有限公司;恒溫培養箱SPX-150B-I上海博迅實業有限公司醫療設備廠;立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-875L-I江陰濱江醫療設備有限公司;分析天平BSA124S合肥匯聯電子有限公司;電熱鼓風干燥箱101-3A天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實驗內容與方法

1.3.1 菌懸液的制備

參照王向陽［11］的方法稍作修改，將細菌、霉菌分別接種在牛肉膏蛋白胨培養液、馬鈴薯葡萄糖培養液中，再分別置于37℃、27℃ 150 r/min的搖床上培養18 h(酵母菌的菌懸液的制備與霉菌相同)，再按照GB/4789.2-2010［12］中的計算公式計算出所配菌懸液的活菌數，將菌懸液調配成105CFU/mL，于4℃的冰箱中保存。

1.3.2 防腐劑溶液的配制

采用微量稀釋法，根據 GB/2760-2011［13］中的要求，脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的最大使用量分別為0.3、1、0.5 g/kg。將定量的防腐劑溶解于無菌水中，再將試劑分別以以下8種梯度加入相應的培養基中，見表1。

表1 防腐劑的濃度梯度Table 1 The concentration gradient of Preservatives

1.3.3 典型菌的選取

采用測定MIC值的方法，選取對防腐劑反應遲緩的、生長顯著的作為復配防腐劑選擇的典型菌。

1.3.4 響應面的優化

同一功能的食品添加劑(相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑)在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應超過1［13］。根據3種防腐劑對13種腐敗菌的MIC值的平均值結果，來選取合適的濃度。采用3因素3水平的Box-Behnken的設計對脫氫醋酸鈉(A)、苯甲酸鈉(B)、山梨酸鉀(C)進行復配，以抑菌圈直徑為響應值，確定3種防腐劑的最優配比。試驗因素編碼和水平見表2。

表2 Box-Behnken響應面設計試驗因素水平和編碼Table 2 Response surface of experimental factor levels

1.3.5 測定的方法

1.3.5.1 MIC值的測定

在無菌條件下，將防腐劑添加于培養基中，待培養基凝固后加入0.1 mL的菌懸液，均勻涂布置于的恒溫培養箱中培養并觀察(細菌用營養瓊脂培養，霉菌和酵母菌用虎紅培養基)。細菌菌懸液置于37℃下培養2 d，霉菌菌懸液置于27℃下培養3 d，酵母菌懸液置于27℃下培養3 d。以不加防腐劑的為空白對照組，以培養基平板上完全無菌生長時的防腐劑濃度為 MIC［14］。

1.3.5.2 抑菌圈直徑的測定

參照吳影［15］的方法，將濾紙用打孔器打成6 mm的大小，滅菌后在相應的防腐劑溶液中浸泡40 min后，將其放在已涂布了待測菌的相應的培養基平板中，細菌培養2 d，霉菌和酵母菌培養4 d后測定其抑菌圈的直徑:d=d1-d2

d1:添加防腐劑的抑菌圈直徑;d2:空白組抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 典型菌的確定

不同防腐劑對糟辣椒中的腐敗菌的抑菌效果和差異顯著性結果如圖1所示。

圖1 三種防腐劑對腐敗菌的MIC值Fig.1 MIC’s of three preservatives against typical spoilage bacteria

從圖1可以看出，脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對13種腐敗菌的抑菌效果各不相同。對于這3種防腐劑的MIC進行顯著性分析可以看出:脫氫醋酸鈉對 X1、X3、X5、X7的抑制作用最強，對 X2、X9的抑制作用最弱;苯甲酸鈉對X6、M2的抑制作用最強，對X8、M1有較強的抑制作用，對 X2、X3、X5、X9、X10有較弱的抑制作用;山梨酸鉀對M1、M2的抑制作用最強，對 X3、X6、X8、X10有較強的抑制作用，對 X2、X9的抑制作用最弱。可以看出:3種防腐劑對X2、X9的MIC值最大，因此選擇X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌作為防腐劑復配試驗的典型菌。

2.2 響應面設計結果與分析

以菌X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌為試驗菌進行響應面的優化實驗，以抑菌圈直徑為響應值，利用Design-Expert7.0軟件進行回歸分析，實驗結果見表3。

表3 響應面實驗響應值結果Table 3 The response value results of response surface experimental

2.2.1 X2馬尿片球菌抑菌圈直徑回歸方程的確定

由表4可知，模型的一次項A(脫氫醋酸鈉)、C(山梨酸鉀)都顯著(P＜0.05)，B(苯甲酸鈉)極顯著(P ＜0.01)，二次項 A2、C2顯著(P ＜0.05)，B2顯著(P＜0.01)，交互項AB極顯著(P＜0.01)，BC顯著(P ＜0.05)。

表4 X2馬尿片球菌抑菌圈直徑回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X2Pediococcus urinae-equi

所選模型不同配比間的差異極顯著(P=0.001 5＜0.01)，說明模型間的變量和響應值之間存在著極顯著的線性關系。失擬項P=0.7827＞0.05，沒有顯著性差異，說明試驗數據無異常點，誤差較小;復相關系數的平方為0.941 6，說明擬合程度很好，實驗誤差較小。=0.866 5，說明建立的模型能夠解釋86.65%響應值的變化，能夠很好的反映出抑菌圈的直徑隨著防腐劑添加量不同的變化規律，可以對實驗結果進行分析和預測。對表中所得的數據進行多元回歸擬合，通過分析得A、B、C與X2馬尿片球菌抑菌圈直徑之間的二次多項式模型為:

X2馬尿片球菌的抑菌圈直徑=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

式中:A、B、C分別代表不同防腐劑的編碼值。

2.2.2 X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑回歸方程的確定

由表5可知，模型的一次項C(山梨酸鉀)顯著(P＜0.05)，A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)極顯著(P ＜0.01)，二次項 A2、B2、C2極顯著(P ＜0.01)，交互項AB、BC顯著(P＜0.05)。

表5 X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X9Lactobacillus curvatus

所選模型不同配比間的差異極顯著(P＜0.000 1＜0.01)，說明模型間的變量和響應值之間存在著極顯著的線性關系。失擬項0.913 8＞0.05，不顯著，說明試驗數據無異常點;復相關系數R2=0.974 7，說明該模型擬合程度好。，說明建立的模型能夠解釋94.21%響應值的變化。因此確定可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。對表中所得的數據進行多元回歸擬合，通過分析得A、B、C與X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑之間的二次多項式模型為:

X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

式中:A、B、C分別代表不同防腐劑的編碼值。

2.3 不同因素的交互作用分析

根據回歸方程繪制A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)、C(山梨酸鉀)3個因素對響應值的響應面圖和等高線圖。

2.3.1 A(脫氫醋酸鈉)和B(苯甲酸鈉)交互后最佳抑菌值的確定

從圖2可以看出，A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)之間的交互作用達到顯著水平。將C(山梨酸鉀)固定在零水平，可以得到A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2=6.36+0.23A+0.45B-0.39AB-0.30 A2-0.40B2

X9=6.50+0.31A+0.42B-0.21AB-0.55A2-0.67B2

可以看出，隨著A和B添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是A和B添加量過高都不利于對X2和X9的抑制，所以A(脫氫醋酸鈉)為0.1 mg/mL，B(苯甲酸鈉)為0.22 mg/mL在，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

圖2 A(脫氫醋酸鈉)和B(苯甲酸鈉)響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and sodium benzoate

2.3.2 A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)交互后最佳抑菌值的確定

從圖3可以看出，A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)之間的交互作用不顯著。將B(苯甲酸鈉)固定在零水平，可以得到A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2馬尿片球菌 =6.31+0.23A+0.20C-0.085AC-0.30A2-0.27C2

X9彎曲乳桿菌 =6.37+0.31 A+0.18C-0.077AC-0.57A2-0.39C2

同時，隨著A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量過高都不利于對X2馬尿片球菌、X9彎曲乳桿菌的抑制，所以A(脫氫醋酸鈉)為0.1 mg/mL，C(山梨酸鉀)為0.14 mg/mL時，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

圖3 A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)響應面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and potassium sorbate

2.3.3 B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)交互后最佳抑菌值的確定

從圖4可以看出，B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)之間的交互作用達到顯著水平。將A(脫氫醋酸鈉)固定在零水平，可以得到B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2馬尿片球菌 =6.35+0.45B+0.20C-0.26BC-0.40B2-0.27C2

X9彎曲乳桿菌 =6.42+0.42B+0.18C-0.22BC-0.68B2-0.39C2

同時，隨著B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量過高都不利于對X2馬尿片球菌、X9彎曲乳桿菌的抑制，所以B(苯甲酸鈉)為0.22 mg/mL，C(山梨酸鉀)為0.14 mg/mL時，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

2.3.4 模型的優化和驗證

通過分析可以得到最佳的工藝參數為:A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)最佳添加量分別為0.1 mg/mL、0.22 mg/mL、0.14 mg/mL。做3組平行實驗，得到X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑平均值分別為6.61 mm和6.73 mm，與理論預測值6.59 mm和6.75 mm非常接近，說明了該模型可以很好的預測防腐劑的量與抑菌圈直徑的關系，同時證明響應面優化得到的最優配方的可行性。

3 結論

通過測定出A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)3種防腐劑對糟辣椒中13種腐敗菌的最低抑菌濃度MIC值，得到X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的繁殖能力和對這3種防腐劑的抗性均較強，為簡化實驗，以這兩種菌作為典型菌進行響應面的優化實驗。通過響應面法建立了A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)與抑菌直徑的回歸模型:

X2馬尿片球菌的抑菌圈直徑=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

根據回歸方程和實際情況，最終得到最佳配方的添加量為A(脫氫醋酸鈉)0.1 mg/mL、B(苯甲酸鈉)0.22 mg/mL、C(山梨酸鉀)0.14 mg/mL，在最佳配方測得X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑分別為6.61 mm和6.73 mm，具有明顯效果。

圖4 B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium benzoate and potassium sorbate

［1］ Meldrum R J，Little C L，Sagoo S，et al.Assessment of the microbiological safety of salad vegetables and sauces from kebab take-away restaurants in the United Kingdom［J］.Food Microbiology，2009，26(6):573-577.

［2］ 羅聯鈺.袋裝泡菜防腐劑［J］.保鮮與加工，2002(1):27-28.

［3］ 曹寶忠.影響醬腌菜質量的因素及防腐劑應注意的問題探討［J］.中國釀造，2011(3):145-149.

［4］ 陳滿全，醬腌菜防腐措施的研究［J］.食品開發與研究，2004，25(3):141-144.

［5］ 呂娜.食品防腐劑苯甲酸鈉的毒理學研究［D］.長春:吉林農業大學，2006..

［6］ 彭家澤.脫氫醋酸鈉及其復配形式在食品中的防腐應用研究［J］.中國食品添加劑，2007(9):253-257.

［7］ 尼泊金酯類在食品工業中的應用［J］.中國食品添加劑，2003(1):118-121.

［8］ 謝田，賴萍.脫氫醋酸鈉對糟辣椒發酵及保藏品質的影響［J］.貴州農業科學，2008(2):151-154.

［9］ 李達，王知松，楊詠鵑，譚書明，丁筑紅.殼聚糖對糟辣椒發酵作用及保藏特性影響［J］.食品研究與開發，2009，30(7):136-140.

［10］ 孫磊.腌制蔬菜復合防腐劑的開發與應用研究［D］.安徽:合肥工業大學，2010.

［11］ 王向陽，施青紅.胖袋腌蘿卜干中致病微生物鑒定及防腐研究［J］.中國食品學報，2006，6(2):103-108.

［12］ GB/4789.2-2011.食品添加劑使用衛生標準［S］.中華人民共和國衛生部，2010-06-01.

［13］ GB/2760-2010.食品微生物學檢驗-菌落總數測定［S］.中華人民共和國衛生部，2011-04-20.

［14］ 張慧云，孔保華，孫旭.丁香提取物的成分分析及對肉品中常見腐敗菌和致病菌的抑菌效果［J］.食品工業科技，2009，11(30):85-88.

［15］ 吳影.辣椒中辣椒堿抑菌作用的研究［J］.安徽農業科學，2007，35(29):9130-9131.