高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定雞肉中的18種氨基酸

金明，牛宏亮，袁輝，趙煜

(甘肅省輕工研究院，甘肅蘭州，730000)

雞肉中富含蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的質(zhì)量主要取決于氨基酸的組成和比例，尤其是必需氨基酸的組成和比例［1］。在目前儀器分析的領(lǐng)域中，禽肉類產(chǎn)品中多種氨基酸的分析方法的相關(guān)報(bào)道較少。最常用的分析方法有:氨基酸專用分析儀分析，高效液相色譜聯(lián)合柱前衍生系統(tǒng)分析，高效液相色譜柱后衍生法分析等。但是氨基酸專用分析儀的價(jià)格昂貴，專屬性強(qiáng)，儀器利用率低;高效液相色譜柱前衍生法分析自動(dòng)化程度低、對(duì)柱子的損害大、前處理繁瑣;而高效液相色譜柱后衍生法分析彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn)——自動(dòng)化程度高、衍生物的穩(wěn)定性高、對(duì)柱子的損害小、前處理簡單［2］，尤其在一些中小型實(shí)驗(yàn)室，能夠?qū)崿F(xiàn)液相色譜檢測(cè)方法和液相色譜柱后衍生法之間的及時(shí)切換，提高了儀器的使用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美國七彩山雞肉，甘肅敦煌酒業(yè)有限公司提供。

18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:天門冬氨酸99.4%、蘇氨酸99.1%、絲氨酸 99.6%、谷氨酸 98.9%、甘氨酸98.8%、丙氨酸99.4%、纈氨酸99.4%、半胱氨酸99.1%、蛋氨酸99.2%、異亮氨酸99.4%、亮氨酸99.5%、酪氨酸99.4%、苯丙氨酸99.9%、脯氨酸99.0%、組氨酸99.5%、色氨酸99.1%、鹽酸賴氨酸99.2%、精氨酸99.0%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院;TRIONE?茚三酮柱后衍生試劑(型號(hào)T100C、色譜純)、酸性洗脫液Li275、中性洗脫液Li750、色譜柱再生液RG003等試劑，美國Pickering公司;石油醚(分析純)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;HCl(優(yōu)級(jí)純)，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200高效液相色譜分析儀(配有四元泵、紫外檢測(cè)器和真空在線脫氣機(jī))，美國安捷倫科技有限公司;Pickering PCX柱后衍生儀(配有Pickering離子交換柱及Pickering PCX工作站)，美國Pickering公司;真空干燥箱(DZG-6050)，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱;數(shù)控超聲波清洗器，上海科導(dǎo)有限公司;離心機(jī)，長沙湘儀儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

根據(jù)各個(gè)氨基酸在色譜圖上的響應(yīng)值高低不同，為使它們的響應(yīng)值在色譜圖上一致，配制混標(biāo)時(shí)，將各個(gè)單標(biāo)的濃度配制在40～160 μg/mL內(nèi)［3］。

1.3.2 樣品處理

雞肉需要取不同部位絞碎、稱量2.0～5.0 g，采用石油醚索氏抽提4～6 h，除去樣品中的脂肪，烘干。將樣品轉(zhuǎn)入到帶塞的玻璃試管中加入6mol/L HCl，經(jīng)抽真空充入氮?dú)夥庾≡嚬芸冢?10℃烘箱內(nèi)恒溫水解24 h，取出放置冷卻，將水解液用濾紙過濾到50 mL的容量瓶中用去離子水定容，再吸取1～2 mL于10 mL容量瓶內(nèi)，50℃真空干燥后用去離子水定容，過 0.45 μm 膜，上機(jī)檢測(cè)［4］。

1.3.3 色譜分析條件

離子交換柱:Lithium Ion-exchange Column，3.0 mm ×250 mm;保護(hù)住(Lithium Guard Column)，2.0 mm×2.mm，紫外檢測(cè)波長570 nm;反應(yīng)器溫度，130℃;衍生試劑，茚三酮;衍生試劑流速0.30 mL/min;柱溫，40℃;進(jìn)樣體積，10 μL。梯度洗脫條件:流動(dòng)相流速0.32 mL/min，按表1中的條件進(jìn)行梯度洗脫［5］

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for the gradient elution program used in the chromatograph analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)中選用的流動(dòng)相為 Li275、Li750、RG003的梯度洗脫。Li275為酸性洗脫液，Li750為中性洗脫液，RG003為色譜柱再生液，全部由美國Pickering公司提供，使用該流動(dòng)相時(shí)儀器響應(yīng)信號(hào)較高。在這個(gè)流動(dòng)相體系的梯度下洗脫，各個(gè)組分的分離比較好，得到滿意的色譜圖。

2.2 樣品前處理方法

由美國 Pickering公司提供的 SERAPREP和URIPREP 2種樣品前處理試劑對(duì)雞肉類樣品并不適用。通過實(shí)驗(yàn)證明，還是傳統(tǒng)的將樣品經(jīng)過索氏抽提去除脂肪后再用HCl水解的方法比較實(shí)際，雖然時(shí)間較長，但是樣品回收率比較高。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和雞肉樣品色譜圖

圖1 18種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Chromatograms of 18 mixed standards amion acids

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

圖2 雞肉自身樣品中的18中氨基酸Fig.2 Chromatograms of 18 mixed amion acids in chicken sample

準(zhǔn)確吸取已配制好的18種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、8、10、20 μL 進(jìn)樣，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，其回歸方程分別和相關(guān)系數(shù)分別為:Y=5.26e+004x+1.37e+002，r=0.999 2;Y=5.35e+004x-1.47e+003，r=0.999 0;Y=3.93e+004x+2.51e+002，r=0.999 5。表明18種氨基酸在8 ～80 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。其他氨基酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

2.5 方法的精密度、重復(fù)性和回收試驗(yàn)

精密度試驗(yàn):準(zhǔn)確吸取18中氨基酸混標(biāo)10μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，計(jì)算其RSD分別為0.87%、0.81%、0.95%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):準(zhǔn)確稱取5份樣品，按樣品處理方法處理制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，計(jì)算其RSD分別為 1.2%、0.9%、1.1%(n=5)。

取已經(jīng)測(cè)得含量的樣品溶液，分別加入18種氨基酸混標(biāo)溶液，0.5、1、2 mL，其中以天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為例，測(cè)得其平均回收率和相關(guān)系數(shù)分別為:102.5%(RSD=1.15%)、92.4%(RSD=1.04%)、87.6%(RSD=0.94%)。

其他氨基酸的精密度、重復(fù)性和回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 試驗(yàn)方法線性、精密度、重復(fù)性、回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)表Table 2 linear，precision，repeatability，recovery of test method

2.6 七彩山雞不同部位雞肉中的氨基酸組成

按照上述1.3.2的樣品處理方法和1.3.3的色譜條件，對(duì)七彩山雞不同部位肉的18種氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。

表3 七彩山雞不同部位肉中18種氨基酸的含量Table 3 The content of 18 amino acid in different parts of chicken

從表3中得出:七彩山雞雞肉中18種氨基酸的平均含量為:天冬氨酸18.78 mg/g、蘇氨酸9.96 mg/g、絲氨酸 9.16 mg/g、谷氨酸 10.28 mg/g、甘氨酸12.31 mg/g、丙氨酸11.71 mg/g、纈氨酸10.18 mg/g、半胱氨酸 2.48 mg/g、蛋氨酸 5.72 mg/g、異亮氨酸8.49 mg/g、亮氨酸 11.22mg/g、酪氨酸 9.05 mg/g、苯丙氨酸9.44 mg/g脯氨酸9.66 mg/g、組氨酸3.15 mg/g、色氨酸 6.14 mg/g、鹽酸賴氨酸 8.97 mg/g、精氨酸10.91 mg/g，雞腿肉中各個(gè)氨基酸含量水平最高。整個(gè)雞肉中必需氨基酸(EAA)的含量為70.12 mg/g，氨基酸總量(TAA)為167.61 mg/g。非必需氨基酸(NEAA)含量為 97.49mg/g。EAA/TAA為41.84%，EAA/NEAA為0.72，分別超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應(yīng)為40%左右和EAA/NEAA應(yīng)為0.6以上的參考蛋白質(zhì)模式標(biāo)準(zhǔn)［6-8］。

2.7 七彩山雞肉中與普通市售雞肉樣品中18種氨基酸含量的比較

經(jīng)過計(jì)算，普通雞肉中必需氨基酸(EAA)的含量為:57.96 mg/g，氨基酸總量(TAA)為:141.77 mg/g。非必需氨基酸(EAA)的含量為:83.81 mg/g。EAA/TAA為:40.88%，EAA/NEAA為0.69，分別超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應(yīng)為40%左右和EAA/NEAA應(yīng)為0.6以上的參考蛋白質(zhì)模式標(biāo)準(zhǔn)。但是都低于美國七彩山雞肉中EAA/TAA和EAA/NEAA 的比值［9-10］。

表4 七彩山雞肉和普通雞肉樣品中18種氨基酸含量對(duì)比數(shù)據(jù)表Table 4 The contrast data of 18 amino acid，content in colorful montain chicken and ordinayr chicken

3 結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法可行性

采用石油醚索氏抽提去除脂肪，6 mol/L鹽酸水解樣品。并且優(yōu)化了色譜條件，采用Lithium Ion-exchange色譜柱(3.0 mm×250 mm)，流動(dòng)相采用Li175、Li750、RG003的梯度洗本文研究了高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定雞肉中18種氨基酸的前處理方脫。以TRIONE茚三酮為柱后衍生試劑，檢測(cè)波長為570 nm。試驗(yàn)方法的線性回歸、精密度、重復(fù)性、回收率等試驗(yàn)都滿足檢測(cè)的要求。方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，分離效果好，選擇性高，檢測(cè)靈敏度高，方法穩(wěn)定，同時(shí)適用于其他各種肉類產(chǎn)品中18種氨基酸的檢測(cè)。并且分析了雞肉中氨基酸的種類和比例，EAA/TAA為:41.84%，EAA/NEAA為0.72，分別超過 WHO/FAO提出的EAA/TAA應(yīng)為40%左右和EAA/NEAA應(yīng)為0.6以上的參考蛋白質(zhì)模式標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 雞肉樣品中18種氨基酸的含量

分別對(duì)美國七彩山雞肉和市售普通雞肉中的18種氨基酸進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，2種雞肉中EAA/TAA和EAA/NEAA的比值分別都超過WHO/FAO提出的EAA/TAA應(yīng)為40%左右和EAA/NEAA應(yīng)為0.6以上的參考蛋白質(zhì)模式標(biāo)準(zhǔn)。但是二者比之，七彩山雞肉的EAA/TAA和EAA/NEAA的比值比普通市售雞肉更高。

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