電子鼻結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法分析大菱鲆冷藏過(guò)程中揮發(fā)性成分變化*

徐永霞，劉瀅，姜程程，張朝敏，儀淑敏，勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

大菱鲆，俗稱歐洲比目魚，在我國(guó)又稱“多寶魚”，是原產(chǎn)于土耳其北部沿岸的一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鲆鰈魚物種。自1992年引進(jìn)至今，大菱鲆養(yǎng)殖已經(jīng)發(fā)展成為年產(chǎn)量超過(guò)6萬(wàn)噸的海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)主要集中在黃海北部和環(huán)渤海等北部沿海地區(qū)［1］。大菱鲆肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，大菱鲆相關(guān)的研究主要集中于餐桌飲食［2］、免疫學(xué)［3］、基因組學(xué)［4］、養(yǎng)殖和保鮮等方面，而對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。

近年來(lái)，針對(duì)于有復(fù)雜介質(zhì)或含協(xié)同效應(yīng)揮發(fā)性成分的樣品而建立的氣味指紋技術(shù)已運(yùn)用于水產(chǎn)品風(fēng)味方面的檢測(cè)［5］。固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)技術(shù)是一種新型的無(wú)溶劑樣品處理方法，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，簡(jiǎn)單方便，將SPME和氣質(zhì)聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用能夠?qū)]發(fā)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量［6］。而電子鼻(electronic nose，E-nose)作為一種集分析、識(shí)別、檢測(cè)復(fù)雜揮發(fā)性成分功能于一體的新型儀器，具有客觀、準(zhǔn)確、重復(fù)性好及無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)［5］。本研究采用電子鼻和SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)大菱鲆魚肉中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和鑒定，比較了其新鮮和腐敗2個(gè)階段揮發(fā)性氣味的差異，期望為大菱鲆風(fēng)味的深入研究及品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮養(yǎng)殖大菱鲆，購(gòu)于錦州市林西水產(chǎn)市場(chǎng)，質(zhì)量約600～800 g/尾;C8～C20正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司;NaCl、MgO均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng)，德國(guó)AIRSENSE公司;Agilent 7890N/5975氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀，美國(guó)Agilent公司;固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶，美國(guó)Supelco公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;Foss Kjeltec 8400，瑞典福斯集團(tuán)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方式

將鮮活大菱鲆采用碎冰凍死，清洗瀝干后用蒸煮袋包裝于4℃冰箱中貯藏直至腐敗。

1.3.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

感官評(píng)定:參照 Duflos［7］等人的方法并稍作修改，由6位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的感官評(píng)定人員對(duì)魚的氣味、質(zhì)地、外粘液、眼球和魚鰓等進(jìn)行評(píng)分，各指標(biāo)的感官評(píng)定分值在0～3分之間;分值越低表明樣品品質(zhì)最好，0分代表最佳品質(zhì)，3分代表最差品質(zhì)。

細(xì)菌總數(shù)(TVC)的測(cè)定:根據(jù)GB/T 4789.2-2010的方法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)［8］。

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定:參照FOSS方法［9］，采用自動(dòng)定氮儀測(cè)定。結(jié)果表示為mg N/100 g魚肉。

1.3.3 電子鼻檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)絞碎的魚肉1.0 g于25 mL的燒杯中，迅速用保鮮膜封口后置于4℃冰箱中靜置30 min。電子鼻測(cè)定時(shí)間為100 s，頂空溫度25℃，內(nèi)部流量300 mL/min，進(jìn)樣流量300 mL/min。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述見(jiàn)表1。

1.3.4 GC-MS分析

固相微萃取:準(zhǔn)確稱取經(jīng)絞碎的魚肉3.0 g于20 mL頂空瓶中，加入6 mL飽和NaCl溶液及磁轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯隔墊密封，于60℃磁力攪拌器中加熱平衡15 min。用已活化好的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭(270℃活化60 min)頂空吸附40 min后，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解吸5 min。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。

氣相色譜條件:HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度為250℃，不分流模式進(jìn)樣;載氣為He，流速1.0 mL/min;程序升溫:柱初溫40℃，保持3 min，以3℃/min升至100℃，再以5℃/min升至230℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃;離子化方式:EI;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍30～550(m/z)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

電子鼻數(shù)據(jù)分析:取穩(wěn)定后第84 s～88 s這5 s的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行主成分分析(PCA)。

表1 PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

GC-MS數(shù)據(jù)分析:樣品中揮發(fā)性成分的定性分析采用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST 11/Wiley 7.0)進(jìn)行檢索，并利用C8～C20正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算各個(gè)色譜峰的保留指數(shù)，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成。揮發(fā)性成分的定量分析采用峰面積歸一化法。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)新鮮度評(píng)價(jià)指標(biāo)分析

新鮮及腐敗魚肉的感官評(píng)分、細(xì)菌總數(shù)和TVBN值如表2所示。整個(gè)貯藏過(guò)程中大菱鲆的感官評(píng)分值逐漸升高，說(shuō)明其品質(zhì)逐漸下降，在20d時(shí)感官品質(zhì)不可接受。由表2可知，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)菌落總數(shù)逐漸增加，貯藏20 d時(shí)已超過(guò)國(guó)標(biāo)規(guī)定的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［10］。TVB-N是評(píng)價(jià)魚類新鮮度的重要指標(biāo)，當(dāng)TVB-N值達(dá)到30 mg/100 g被認(rèn)定為貨架期終點(diǎn)［11］。大菱鲆貯藏過(guò)程中的TVB-N值逐漸升高，第20天的TVB-N值為44.34 mg N/100 g。通過(guò)以上指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明，貯藏20 d的魚肉已達(dá)到腐敗階段。

表2 新鮮及腐敗大菱鲆魚肉新鮮度指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of freshness indices of fresh and spoiled turbots

2.2 電子鼻檢測(cè)

采用電子鼻檢測(cè)分析新鮮和腐敗魚肉樣品的氣味差異，結(jié)果如圖1和2所示。由圖1可以看出，新鮮和腐敗魚肉樣品的風(fēng)味輪廓之間存在顯著差異，響應(yīng)值變化較為明顯的傳感器由大到小分別是R(7)、R(9)、R(6)和R(2)，這說(shuō)明相比新鮮魚肉樣品，腐敗魚肉中無(wú)機(jī)硫化物R(7)、芳香成分和有機(jī)硫化物R(9)、烷烴類R(6)和氮氧化合物R(2)的含量明顯升高，從而使得腐敗樣品中呈現(xiàn)出臭味。同時(shí)采用SPSS19.0軟件分析新鮮及腐敗魚肉風(fēng)味對(duì)10個(gè)傳感器的響應(yīng)值可得出2種樣品的相關(guān)性系數(shù)為0.814，說(shuō)明其差異性較顯著。為進(jìn)一步表征新鮮和腐敗魚肉樣品之間氣味的差異，采用PCA法對(duì)這些氣味指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)。由圖2可知，第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.87%，PC1和PC2貢獻(xiàn)率之和達(dá)到99.98%，能較好地反映原始高維矩陣數(shù)據(jù)的信息，說(shuō)明電子鼻能有效區(qū)分新鮮和腐敗魚肉的氣味變化。該方法的分析結(jié)果與感官評(píng)分、菌落總數(shù)和TVB-N值的變化相一致。此外，用GC-MS對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行進(jìn)一步分析和鑒定。

圖1 新鮮及腐敗魚肉樣品的氣味感應(yīng)強(qiáng)度雷達(dá)圖Fig.1 The radar chart of odour in fresh and spoiled turbot samples

圖2 新鮮和腐敗魚肉樣品的PCA分析Fig.2 PCA plot of fresh and spoiled turbot samples based on electronic nose signals

2.3 GC-MS分析結(jié)果

新鮮及腐敗的大菱鲆魚肉中揮發(fā)性成分組成及其相對(duì)含量見(jiàn)表3。分別鑒定出27、28種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、烴類、芳香族和胺類化合物等。圖3為新鮮和腐敗魚肉中檢測(cè)到的各類揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量及組成。由圖3可知，醛類、酮類和醇類物質(zhì)在新鮮魚肉中相對(duì)含量較高，而腐敗魚肉中胺類物質(zhì)的相對(duì)含量較高。非常新鮮的魚通常具有柔和的、淺淡的、令人愉快的氣味，而鮮魚的這種氣味通常是由醛類、醇類和醇類引起的［12］。

2.3.1 羰基化合物

羰基化合物包括醛類和酮類物質(zhì)，在水產(chǎn)品氣味特征中起重要作用。醛類是大菱鲆主要的揮發(fā)性物質(zhì)之一，在新鮮和腐敗的魚肉中分別檢測(cè)到5、7種醛類物質(zhì)，其相對(duì)含量分別為25.64%和14.94%。醛類物質(zhì)主要由多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生，且閾值很低，尤其是C6～C12的飽和醛類物質(zhì)的閾值極低，對(duì)魚類總體氣味特征有重要影響［13］。其中己醛具有青草味、腥味，庚醛具有果香，壬醛具有魚腥味，苯甲醛具有令人愉快的堅(jiān)果香。由表3可知，這4種醛類物質(zhì)在新鮮魚肉中的相對(duì)含量明顯高于腐敗魚肉。3-甲基丁醛僅在腐敗魚肉中檢出，這種物質(zhì)可能是由Strecker降解或微生物活動(dòng)產(chǎn)生［14］。研究報(bào)道［15］，煮熟的去皮蝦肉冷藏期間感官品質(zhì)的劣變與3-甲基丁醛的產(chǎn)生密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中共檢出4種酮類物質(zhì)，在新鮮魚肉中的相對(duì)含量較大，尤其是2，3-辛二酮和(E，E)-3，5-辛二烯-2-酮。酮類物質(zhì)具有特殊的香氣，由于其閾值較高，對(duì)魚肉氣味的貢獻(xiàn)相對(duì)較小［16］，但酮類對(duì)腥味具有增強(qiáng)作用，尤其是烯酮類化合物。

2.3.2 醇類化合物

醇類物質(zhì)主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來(lái)的。大菱鲆中檢出的醇類含量也較大，在新鮮和腐敗魚肉中分別為24.79%和18.32%。醇類物質(zhì)一般閾值較高，對(duì)整體氣味的貢獻(xiàn)較小。但不飽和醇閾值相對(duì)較低，具有蘑菇香氣和類似金屬味，對(duì)魚肉風(fēng)味有一定作用。其中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇在新鮮魚肉中的含量遠(yuǎn)高于腐敗魚肉，研究發(fā)現(xiàn)，這2種醇類化合物可能是熏制鮭魚鮮度指示物［17］。而3-甲基-1-丁醇僅在腐敗魚肉中檢出，且相對(duì)含量較高。研究報(bào)道，3-甲基-1-丁醇與微生物的代謝有關(guān)，可能是魚類腐敗變質(zhì)的潛在揮發(fā)性指示物［14］。

圖3 新鮮及腐敗大菱鲆魚肉揮發(fā)性成分的比較Fig.3 Comparison of volatiles compounds in fresh and spoiled turbot flesh

2.3.3 烴類及芳香族化合物

由表3可知，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到較多的烴類物質(zhì)(烯烴類和烷烴類)。烯烴類化合物在一定條件下可形成醛和酮，是產(chǎn)生魚腥味的潛在因素。其中D-檸檬烯在新鮮和腐敗2個(gè)階段均被檢出，且相對(duì)含量較大。檸檬烯類物質(zhì)可能產(chǎn)生于周圍的環(huán)境中［18］。C8～C19的烷烴類物質(zhì)氣味閾值較高，因此對(duì)魚肉整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小。此外，在新鮮和腐敗魚肉中均檢測(cè)到3種芳香族化合物，包括對(duì)傘花烴、萘和丁羥甲苯，這類化合物可能來(lái)自環(huán)境中的污染物。其中，萘已在龍蝦、扇貝和蟹中檢出［19］。

表3 新鮮及腐敗大菱鲆魚中揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 3 Volatile compounds of fresh and spoiled turbot flesh analyzed by GC-MS

2.3.4 胺類及其他化合物

魚體中胺類化合物主要是由于各種氨基酸在細(xì)菌的脫羧作用下生成的，這些物質(zhì)一般都有腥臭味［12］。由表3可知，在腐敗魚肉中檢測(cè)出三甲胺，且含量很高。三甲胺是三甲胺氧化物在細(xì)菌酶的作用下產(chǎn)生的，呈現(xiàn)出令人不愉快的氨味并廣泛存在于水產(chǎn)品中，通常作為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度的一個(gè)重要指示物［20］。實(shí)驗(yàn)中共檢出4種酯類物質(zhì)，這類物質(zhì)在新鮮魚肉中的相對(duì)含量高于腐敗魚肉。此外，在腐敗魚肉中檢出乙酸。乙酸主要由乳酸菌作用產(chǎn)生的，會(huì)產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的令人不愉快的汗味，Jónsdóttir等人研究認(rèn)為乙酸為熏制鮭魚腐敗等級(jí)的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一［21］。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定大菱鲆在4℃冷藏過(guò)程中的感官、菌落總數(shù)和TVB-N值等指標(biāo)的變化，確定魚肉在貯藏20d時(shí)已達(dá)到腐敗階段。電子鼻結(jié)果顯示，新鮮和腐敗魚肉的氣味差異明顯，電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析可以很好地區(qū)分新鮮和腐敗魚肉樣品，該方法的分析結(jié)果與傳統(tǒng)指標(biāo)的變化相一致;GC-MS分析結(jié)果表明，在新鮮和腐敗魚肉中分別檢測(cè)到27和28種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醛類、酮類和醇類物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量較高，而胺類物質(zhì)在腐敗魚肉中含量較高。其中己醛、庚醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和 1-辛烯-3-醇等物質(zhì)在新鮮魚肉中的含量明顯高于腐敗魚肉，可能作為表征魚肉新鮮的揮發(fā)性指示物，而3-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、三甲胺僅在腐敗魚肉中檢出，且相對(duì)含量較高，可能作為魚肉腐敗的標(biāo)志物。

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