干酪脂類的代謝及其對風味的作用*

侯建平，劉振民，杭峰，于華寧，郭本恒，李云飛

1(光明乳業股份有限公司乳業與生物技術國家重點實驗室，上海，200436)

2(上海交通大學農業與生物學院食品科學與工程系，上海，200240)

干酪成熟經歷了復雜的變化，這些變化至少涉及形成風味的3條主要途徑:糖酵解作用、蛋白質水解作用和脂解作用。蛋白質水解作用包括蛋白質的水解及氨基酸的代謝，脂解作用包括脂類的水解和脂肪酸的代謝。雖然脂解作用在天然干酪中普遍存在，然而脂解作用對干酪風味的重要性也只在近些年才得到普遍的認可，這主要是因為干酪中脂解作用及其代謝終產物的研究缺乏明確的分析方法。隨著以氣相色譜和質譜為基礎開發的可靠分析方法的出現，這些障礙才逐漸得到克服［1-2］。

1 干酪中的脂類和脂肪酸

干酪中的脂類主要來自于原料乳。通常情況下，牛乳中約有35～50 g/L的脂類，其含量的多少取決于泌乳期、飼養條件等情況。牛乳中有超過400種的脂肪酸，主要的游離脂肪酸為丁酸(C4∶0)、己酸(C6∶0)、辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、軟脂酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、順-9-十八碳烯酸 (C18∶1)、順，順-9，12-十八碳二烯酸(C18∶2)、9，12，15-十八碳三烯酸(C18∶3)等。軟脂酸和硬脂酸是牛乳中含量最多的2種游離脂肪酸，分別占總脂肪的25%和27%［3］。

牛乳中主要的脂類是甘油三酸酯(結構如圖1-A所示)，約占脂類總量的98%。脂肪酸在甘油三酸酯中的位置并不是隨機的，具有一定的規律性，C18∶0主要酯化在sn-1位置，C4∶0主要酯化在sn-3位置，C6∶0和不飽和脂肪酸主要在sn-1與sn-3位置發生酯化，隨著脂肪酸碳鏈長度增加到C16∶0，其在sn-2位置酯化的比例增大。不同動物乳的脂肪酸組成比例和脂肪酸所處的位置有所差異，奶牛和水牛比較相似，山羊和綿羊比較接近［4］。

牛乳中磷脂不到總脂類的1%，但磷脂在乳脂肪球膜(MFGM)中卻發揮著重要的作用，這是因為磷脂是兩性分子，具有強烈的表面活性。無論是水包油還是油包水乳液，都能夠被磷脂所穩定。就組成磷脂的脂肪酸的碳鏈而言，磷脂中的脂肪酸比甘油三酸酯中的碳鏈更長，不飽和度更高。牛乳中主要的磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂。牛乳中其他微量脂類還有神經酰胺、腦苷脂和神經節苷脂。膽固醇是牛乳中主要的甾醇類，約占總脂類的0.3%，占總甾醇的95%以上［5］。乳脂肪球膜是包含蛋白質、磷脂、膽固醇、糖蛋白、甘油三酸酯、酶和其他微量成分的復雜的混合體系，可以作為天然的乳化劑使脂肪分散在牛乳的水相中［6］。磷酸脂酶(Phospholipases)可以將MFGM的磷脂水解為甘油、脂肪酸、磷酸以及膽堿、乙醇胺等，使得乳脂易于被酯酶和脂肪酶水解［7］。

高溫或攪拌可破壞乳脂肪球膜的物理結構，使部分乳脂肪球中游離的脂肪漂浮到表面而發生脂解作用。因此原料乳在均質前或均質后需要立即進行殺菌，以防止水解酸敗發生。

生產乳制品的原料乳經常要進行均質，而對于制作干酪的原料乳來說通常不進行均質，因為均質的原料乳形成的凝乳塊在切割和攪拌過程中比沒有經過均質的原料乳形成的凝乳塊難以進行脫水作用，使制作的干酪具有較高的含水量。這是因為酪蛋白包被了脂肪球，限制了干酪酪蛋白基質的收縮。而對于低脂干酪來說，均質的原料乳可以使其具有較高的含水量，使干酪的質構稍軟一些。有時，制作藍紋干酪的原料乳也進行分離并對奶油進行均質來促進脂肪水解作用［3］。

脂類對干酪的質量起著重要的作用。它可以影響干酪的質構和流變特性，也作為脂肪酸的來源，進一步代謝為風味化合物。而且，脂類也是風味成分的良好溶劑，并在干酪消費的過程中使風味成分得以釋放，同時脂類也為一些反應提供了水乳兩相界面［3］。

2 干酪中的脂解作用和參與其中的酶

食品中的脂類，尤其是多不飽和脂肪酸，可發生氧化或水解降解，形成多種不飽和醛，這些不飽和醛具有強烈的風味，產生稱為氧化酸敗的風味缺陷。但是，干酪中的脂類不會發生廣泛的氧化作用，這可能是因為干酪中的氧化還原電位較低(-250mV)和天然抗氧劑(如VE)存在的緣故［8］。因此，在正常情況下，脂類的氧化對干酪風味的影響較小。

脂類影響干酪風味的主要原因是脂類的酶促水解和脂肪酸的代謝。天然干酪中脂類對干酪的典型風味和質地發展起著重要的作用，是一些干酪品種特征風味物質的主要來源［8］。脂解作用產生的脂肪酸，尤其是中短鏈游離脂肪酸的釋放，直接有助于干酪的特征風味［9］。

不同品種干酪中的脂解作用有很大的差異。霉菌成熟干酪脂解作用較高，卡門培爾干酪(Camembert cheese)的甘油三酸酯有5% ～10%發生了脂肪水解作用，丹麥藍紋干酪(Danablu cheese)中的脂解作用更高，多達18%～25%的甘油三酸酯被水解為游離脂肪酸。而意大利帕梅森干酪(Parmigiano-Reggiano cheese)和波河干奶酪(Grana Padano cheese)制作過程中因凝乳熱燙溫度比較高，減少了脂蛋白脂酶在干酪成熟期間的作用，其脂肪水解作用較低一些。此外，對于高達干酪(Gouda cheese)、格里爾干酪(Gruyère cheese)和切達干酪(Cheddar cheese)等來說，甘油三酸酯的水解率更低，不超過2%［3］。

干酪脂解作用是由酯酶或脂肪酶作用的結果。這2種酶的差別主要在于作用的底物脂肪酸碳鏈的長度、底物的物理化學特性和酶反應動力學方面，酯酶水解2～8個碳原子長度的酯?；?，脂肪酶水解10個或更多碳原子的酯?；?酯酶作用于水相可溶性底物，而脂肪酶作用于乳化的底物;酯酶催化作用屬于典型的米凱利斯-門坦反應動力學(Michaelis Menten-type kinetics)，脂肪酶的催化作用發生在兩相的界面處，遵循界面間的米凱利斯-門坦反應動力學［10］。但是在實際應用中，2個酶經常出現相互混用的情況。干酪中的脂解作用的酶來自于牛乳、凝乳酶制劑、發酵劑、附屬發酵劑、非發酵劑乳酸菌和外源性酶制劑中。

牛乳本身的脂肪酶是脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)，其來自于血漿中代謝血漿甘油三酸酯的LPL，牛乳中約有10～20 nmol/L的脂酶。大部分LPL因高溫短時的巴氏滅菌(72℃，15s)而失活，因此LPL在干酪成熟期間其作用并不大［11］。即使在生乳中，大部分LPL的活性為乳脂肪球膜或酪蛋白膠束所阻礙，一旦乳脂肪球膜被破壞便會使得LPL對乳脂肪產生過多水解，導致干酪等乳制品產生不良風味。LPL的脂解作用對生牛乳制作的干酪的風味發展起著重要的作用，而在巴氏殺菌牛乳制作的干酪中殘留LPL的脂解作用對干酪風味的作用較小［11］。LPL水解作用對脂肪酸的類型沒有特定的要求，但偏好水解中等長度碳鏈脂肪酸的甘油酯，鏈長 C6∶0、C8∶0、C10∶0、C12∶0脂肪酸的甘油酯的水解速度比鏈長C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3或 C20∶0脂肪酸甘油酯的水解速度增加了2倍［12］。LPL對脂肪酸在甘油酯的位置有特定要求，只水解甘油一酸酯、甘油二酸酯和甘油三酸酯sn-1和sn-3位置的脂肪酸［13］。

商業化的凝乳酶正常情況下沒有脂解能力。但是，含有脂肪分解酶前胃酯酶(Pregastric esterase，PGE)的凝乳酶漿常被用來制作波蘿伏洛干酪(Provolone cheese)和羅馬諾干酪(Romano cheese)等硬質意大利干酪。PGE盡管名稱中含有酯酶，其實是脂肪酶的一種，水解非水相的甘油三酸酯，PGE對酯化在sn-3位置的短鏈脂肪酸具有高度的特異性［14］，但也可水解長鏈的脂肪酸。來源不同的PGE的脂解作用存在明顯的差異，小牛、小山羊和羔羊的PGE特異性決定了一些干酪品種的風味特征。從屠宰前飼喂不同飲食的羔羊制備的凝乳酶漿制作的意大利費歐洛沙多干酪(Fiore Sardo cheese)，在干酪成熟期間脂解作用水平和游離脂肪酸分布存在明顯的差異［15］。

乳酸菌具有水解甘油三酸酯、甘油二酸酯和甘油一酸酯的酯酶和脂肪酶。一般情況下，乳酸菌的脂肪水解活性與其他細菌和霉菌相比顯得弱一些，許多乳酸菌菌株顯示活性優勢的是酯酶而不是脂肪酶。但是，由于乳酸菌在天然干酪中持續存在，其在干酪長期成熟過程中的脂解作用也是不可忽視的。乳酸菌的酯酶和脂肪酶位于細胞內，需要細胞自體溶解或以其他方式釋放到菌體外才可以接觸到干酪中的反應底物，以具有高度自體溶解的乳乳球菌乳脂亞種AM2(Lactococcus lactis subsp.Cremoris AM2)制作的切達干酪在成熟期間比以不易自體溶解的乳乳球菌乳脂亞種HP(Lactococcus lactis subsp.cremoris HP)制得的干酪產生更多的辛酸(C8∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)等游離脂肪酸［16］。乳酸菌酯酶對C6以上脂肪酸的甘油二酸酯的活性較低，甘油一酸酯是其作用的首選底物，尤其是C8脂肪酸形成的甘油一酸酯。乳酸菌酯酶活性需要注意的另一個方面是其合成反應，在這里酯的合成不僅從醇和甘油三丁酸酯來合成，也可以通過乙醇和甘油酯的醇解作用來合成［3］。丙酸菌的脂解作用尤其值得一提，其活性比乳酸菌強10～100倍，通過將乳酸轉變為乙酸、丙酸和二氧化碳，丙酸菌對瑞士干酪(Swis cheese)特征風味的發展起著重要的作用［17］。

來自細菌、酵母和霉菌的脂肪分解酶常被應用到林堡干酪(Limburger cheese)、布里干酪(Brie cheese)、羅克福爾干酪(Roquefort cheese)和藍紋干酪(Blue cheese)等干酪中，脂肪分解酶的作用對這些干酪的風味特征有著重要的貢獻［3］。表面涂層成熟干酪中亞麻短桿菌(Brevibacterium linens)的脂肪水解活性對成熟期間的脂解作用有重要的作用。Fox等從亞麻短桿菌純化出一種胞內酯酶，該酶對短鏈脂肪酸酯顯示出優先水解的選擇性，能夠從β-萘基底物中釋放出乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸［3］。青霉菌(Penicillium spp.)因具有許多脂酶，常被應用在布里干酪、卡門培爾干酪、洛克福干酪、丹麥藍紋干酪和葛更佐拉干酪(Gorgonzola cheese)等霉菌成熟干酪中［8］，這些青霉菌包括羅克福爾青霉菌(Penicillium roqueforti)、沙門柏干酪青霉菌(Penicillium camemberti)、Penicillium caseiocolum、白青霉(Penicillium candidum)和灰綠青霉菌(Penicillium glaucum)等［7］。羅克福爾青霉菌有2種脂酶，其最優pH分別為7.5～8.0和9.0～9.5;沙門柏干酪青霉菌產生的一種胞外脂酶活性的最優pH為9.0［18］。其他一些微生物也被用來從乳脂合成風味化合物，如解脂無色桿菌(Achromobacter lipolyticum)、米黑毛霉(Mucor miehei)、溶脂念珠菌(Candida lipolytica)、白地霉(Geotrichum candidum)、德氏根霉(Rhizopus delemar)等［7］。白地霉具有一種對雙鍵位于cis-9或cis，cis-9，12的不飽和脂肪酸具有高度特異性的脂酶，尤其對于順-9-十八烯酸(cis-9-octadecanoic acid)具有優先選擇性，這種脂酶的最適pH為5.5～7.5，對某些表面成熟的干酪具有重要的作用［18］。

漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansennii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和勞倫梯隱球酵母(Cryptococcus laurentii)等的脂解作用對干酪成熟具有重要的作用，在干酪制作中常使用一種或多種酵母來釋放更多的游離脂肪酸［3］。

3 脂肪酸的代謝及其對風味的作用

干酪中微生物的脂解作用釋放出游離脂肪酸，這些脂肪酸中的短鏈和中等長度碳鏈的脂肪酸直接有助于干酪的風味。乳脂肪水解產生的長鏈游離脂肪酸(＞C12∶0)對干酪風味的作用比較低，主要是因為這些脂肪酸的風味閾值比較高［19］。短鏈和中等長度鏈長(C4∶0～ C12∶0)的脂肪酸的風味閾值比較低，很容易被感知而表現出明顯的特征風味。丁酸呈現出“酸敗的(rancid)”和“令人不愉快的(cheesy)”風味特點，己酸表現出“辛辣刺激的(pungent)”和“藍紋干酪味的(blue cheese)”風味特點，辛酸給人一種“蠟狀的 (wax)”、“似肥皂的 (soap)”、“山羊味的(goat)”、“發霉的(musty)”、“酸敗的”和“水果味的(fruity)”的風味特征。游離脂肪酸風味的強烈程度不僅取決于其濃度，也取決于其在水相和脂相的分布情況、介質的pH值、某些陽離子(如鈉離子、鈣離子)的存在情況以及蛋白質降解產物的存在情況［20］。

脂解作用對干酪風味更重要的作用在于脂肪酸的進一步代謝。游離脂肪酸可以作為代謝前體被代謝為甲基酮類、內酯類、酯類、烷類和二級醇類等風味化合物(如圖1-B所示)。這些代謝產物對干酪的風味具有更重要的作用。

甲基酮類是干酪中脂肪酸代謝產生的重要風味化合物。甲基酮的產生是霉菌脂肪酶作用的結果，如羅克福爾青霉菌、沙門柏干酪青霉菌、白地霉等，無論是霉菌的孢子還是菌絲體都能產生甲基酮類化合物［21］，甲基酮產生的速率受溫度、pH、霉菌的生理狀態以及游離脂肪酸濃度的影響。需要強調的一點是，甲基酮產生的前體并不僅僅是脂肪酸，酮酸在脂類濃度低的情況下和單不飽和脂肪酸都可以被霉菌用來合成甲基酮類［22］。甲基酮類的還原可以形成二級醇［19］。

甲基酮通常都有很低的風味閾值，如2-庚酮在水中的風味閾值是0.000 9～3.0 mg/kg。2-辛酮、2-壬酮、2-癸酮、甲基正壬酮和甲基正十二烷酮具有“水果味的”、“似花香的(floral)”和“發霉的”氣味特征，2-庚酮具有藍紋干酪的特征風味［23］。甲基酮的蘑菇味和發霉的氣味特征對卡門培爾干酪的風味具有重要的作用［3］。

二級醇來源于脂解作用，對干酪風味的形成也有貢獻。2-丙醇、2-丁醇、2-辛醇和2-壬醇在多數軟質干酪中都有發現，也是藍紋干酪風味的典型化合物成分［24］。1-辛烯-3-醇具有未加工蘑菇的氣味，又被稱為蘑菇醇，其風味閾值為0.01 mg/kg，是卡門培爾干酪整體風味的關鍵成分之一［25］。

酯類和硫酯類化合物也是干酪脂肪酸代謝的揮發性化合物。酯類是游離脂肪酸和醇類發生酯化反應形成的化合物，參與反應的醇類來自于乳糖和氨基酸的代謝。脂肪酸形成的甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等在多種干酪中都已確定［3］。硫酯類是游離脂肪酸和游離的巰基反應生成的產物。微球菌(Micrococcaceae)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)可產生S-甲基硫酯;固定化米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase)可催化短鏈風味硫酯的合成，如硫代丙酸甲酯/乙酯、硫代丁酸甲酯/乙酯、硫代己酸甲酯/乙酯等［26］。

酯類化合物對干酪風味發展重要的原因是因為酯類通常具有較低的風味閾值。分子質量低的酯通常具有“水果味”氣味。高濃度的丁酸乙酯使得格里爾干酪和帕爾馬干酪(Parmesan cheese)具有水果味特征［24］。而在切達干酪，水果特征的風味被認為是一種風味缺陷［8］。硫酯經常是一些食品的特征風味，如洋蔥、大蒜和某些水果。切達干酪揮發性風味活性成分的頂空分析發現，分離出的大部分酯具有“黃油樣的(buttery)”到“水果味的”的氣味，而硫酯具有“令人不愉快的(cheesy)”氣味［27］。

內酯是羥基酸分子內酯化的結果。α-和β-內酯高度活潑，不能穩定存在，但γ-和δ-內酯比較穩定，已在多種干酪中發現。除了羥基酸，一些代謝途徑也可以利用非羥基酸代謝產生內酯，如羅克福爾青霉菌孢子及其營養菌絲體利用長鏈的脂肪酸(C18∶1和C18∶2)生成內酯(C12∶0)［28］

內酯類化合物往往具有強烈的風味，它們不僅對干酪的整體風味的發展具有重要的作用，而且有助于使干酪具有黃油樣絲滑的感覺。δ-內酯具有比較低的閾值，并通常被描述為“桃味的(peach)”、“杏味的(apricot)”和“椰子味的(coconut)”等顯著的水果類的風味特征。γ-內酯比δ-內酯的閾值還要低，γ-辛內酯、γ-癸內酯和γ-十二內酯在水中的閾值為7～11 μg/Kg。γ-C12、γ-C14、γ-C16、δ-C10、δ-C12、δ-C14、δ-C15、δ-C16和 δ-C18內酯都已在切達干酪中鑒定出來［3］。

此外，一些直鏈醛也可以由不飽和脂肪酸的β-氧化而形成，如丁醛、庚醛、壬醛等，這些醛類常常表現出“類似青草的(green grass-like)”的風味［3，19］。

圖1 甘油三酸酯的結構(A)及其代謝途徑(B)Fig.1 Structure of triglycerides and their metabolic pathways

為了縮短干酪成熟時間和確保始終如一的高質量的風味特征，促進干酪風味的形成和改進方法成為研究者長期關注的研究目標。這類研究多數集中于通過乳酸菌和酶技術來提高蛋白質的水解作用，但仍有大量的努力通過外源性的脂肪酶制劑的脂解作用來加快干酪的成熟并取得成功。添加了脂肪酶的藍紋干酪、埃及拉斯干酪(Ras cheese)和多米艾提干酪(Domiati cheese)、意大利的羅馬諾干酪和芳緹娜干酪(Fontina cheese)的脂解作用提高，并在一定程度上增強了它們的感官特性［1］。在添加了羔羊PGE和真菌脂肪酶的伊迪阿扎巴爾干酪(Idiazabal cheese)中其游離脂肪酸分別提高了70%和30%，在感官評價中添加PGE的干酪的風味得分最高［29］。

4 展望

脂解作用對干酪風味發展的影響逐漸得到重視。脂蛋白脂酶和前胃酯酶對干酪風味的作用盡管沒有微生物酯酶和脂肪酶大，但其作用也是不可忽視的。這些酶的作用和進一步代謝產生的化合物對干酪風味的作用仍沒有完全研究清楚。為了更好地發揮這些酶的潛力，需要對這些酶在干酪基質中的活性機制進行更深入的研究。在乳酸菌研究方面，需要闡明的關鍵問題之一是菌體自體溶解和細胞通透性釋放的胞內酶的量化和影響，以及對這些酶在干酪特定的理化環境中的穩定性的量化。為了增強干酪的風味，需要通過發酵劑技術和酶技術篩選或生物技術改造乳酸菌，使得這些乳酸菌具有類似前胃酯酶或脂蛋白酯酶的作用。發酵劑和附屬發酵劑都可以通過氨基酸產生脂肪酸，氨基酸代謝與脂解作用的相互作用也需要進一步研究。此外，在通過提高脂解作用改善干酪風味的過程中也必須考慮干酪成熟過程中氨基酸代謝的作用。

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