復合酶解降低山藥黏液質黏度的工藝

張嬌嬌，許學勤

(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

山藥(Rhizoma dioscoreae)為薯蕷科薯蕷屬蔓生植物的塊莖，其營養成分及生物活性成分較多［1］，具有較高的食用和藥用價值。但新鮮山藥水分含量大，皮薄肉嫩，容易發生機械損傷，既不耐儲藏也不方便運輸，限制了它的流通。多年來，人們圍繞山藥制粉進行了大量的研究，已經報道的山藥粉的制備方法主要有熱風干燥［2-3］、冷凍干燥［4-5］等，但在制備過程中，往往涉及大量水溶性黏液質的流失。山藥黏液質中含有大量蛋白質和多糖，具有較強的持水力［6］，研究發現其對血管緊張肽轉化酶［7］、DPPH·、O2-·及OH·均有較強的抑制作用［8-9］，并有降血壓［10］等活性。

為了利用山藥黏液質，金金［11］曾將打漿后的鮮山藥進行離心分離，分別利用上清液黏液質和沉淀物制粉。但由于黏液質黏度大，無法先濃縮再干燥，只能采用高成本的直接噴霧干燥法制粉。因此，有必要探索適當降低黏液質黏度的方法，以便能在噴霧干燥前，對分離的山藥黏液質進行濃縮，降低干燥成本。顧林［12］、王常青［13］等人曾報道了山藥加工過程中的打漿時間、溫度及pH都會使漿體的黏度發生變化，并認為該變化主要是由于黏液質中的多糖、蛋白質分子變化所致。Takao［14］等人對山藥黏液質的酶解試驗結果也表明，其中的蛋白質及多糖是影響黏液質黏度的重要因素。

本研究采用多種水解酶對山藥黏液質進行酶解，以黏度為指標從中篩選出效果較明顯的酶進行復配酶解試驗，以期最大程度降低黏液質的黏度，從而使山藥黏液質在干燥前能夠得到適當濃縮，以降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥，購于超市。

纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等購于銳陽生物科技有限公司。

AB104-N型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;4K15高速冷凍離心機，美國SIGMA Sartorius公司;LVDV-Ⅱ+P型旋轉黏度計，美國Brookfield公司;DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型廠制造;DKZ-450型電熱恒溫振蕩水槽，上海森信試驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山藥黏液質的制備

選擇新鮮、無病斑的普通山藥，洗凈、去皮、切片，然后將山藥片用高速組織搗碎機(速度12 000 r/min)處理30 s，成為山藥漿。在4℃、10 000 g離心20 min［11］，分離沉淀物和所需的黏液質上清液。

1.2.2 酶解

按試驗設計比例加酶混合均勻，于50℃振蕩水中反應。酶解結束后將反應液在冰水浴中冷卻15 min，終止酶解反應。冷卻的酶解液在4℃、10 000 g離心15min，得到除酶的離心上清液。

1.2.3 溫度對黏液質穩定性的影響

分別將山藥黏液質置于 40、50、60、70、80、90、100℃恒溫水槽中保溫30 min，急冷至4℃，在此溫度下，以10 000 g離心15 min，測定上清液的黏度、蛋白質和多糖含量及抗氧化活性，與未經熱處理的黏液質進行比較。

1.2.4 酶種類的選擇

分別用纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、糖化酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，對打漿后離心得到的黏液質進行酶解，加酶量為黏液質質量的0.4%，在各酶適宜溫度條件下酶解反應70 min，反應結束后冷卻、離心，然后測定上清液的黏度，根據酶解液黏度的降低程度確定進一步試驗用酶的種類。

1.2.5 復合酶解的單因素試驗

酶解溫度∶按纖維素酶:甘露聚糖酶=3∶1的復合酶，加酶量 0.4%，分別于30、40、50、60、70 ℃酶解 70 min。

復合酶配比:分別按纖維素酶∶甘露聚糖酶=4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4添加復合酶 0.4%，50℃酶解70 min。

加酶量:分別按 0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的加酶量，加入纖維素酶∶甘露聚糖酶=3∶1的復合酶，50 ℃反應 70 min。

酶解時間:按纖維素酶∶甘露聚糖酶=3∶1的復合酶配比、酶解溫度50℃、加酶量0.4%，取不同的反應時間 0、20、40、60、80、100、120 min。

1.2.6 復合酶解的正交試驗

在復合酶解單因素實驗的基礎上，以黏液質黏度為考察指標，選擇復合酶配比、酶用量、反應時間3個因素進行3水平正交實驗。

1.2.7 測定方法

1.2.7.1 黏度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋轉黏度計。選擇SC4-18號轉子測定，測溫25℃，轉子轉速80 r/min。

1.2.7.2 總糖

采用苯酚-硫酸快速測定方法。吸取1 mL樣品液，依次加入1 mL 6%的苯酚，搖勻，迅速加入5 mL濃H2SO4，搖勻;空白以1 mL蒸餾水代替樣品液;室溫下放置20 min后，在490 nm處測定樣液的吸光值，通過標準曲線，計算出黏液質中總糖含量。

1.2.7.3 蛋白質的測定

紫外分光光度快速測定法［15］。

1.2.7.4 DPPH·除率的測定

參照江波等人的方法［16］。利用DPPH無水乙醇溶液在517 nm處有紫色團的特征吸收峰，測定加入抗氧化劑后，在517 nm處吸光值的下降表示其對DPPH·的清除能力。

1.2.7.5 總還原力的測定

參照李利華［17］及江波等人［16］的研究方法。

1.2.7.6 清除超氧陰離子能力的測定

參照王震宙［18］等人的試驗方法。

1.2.8 數據處理

利用Origin作圖像處理，文中數據均以3次測定數據的平均值以及標準偏差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 溫度對黏液質的影響

將山藥黏液質置于不同溫度的恒溫水槽中保溫30 min，考察溫度對黏液質黏度及蛋白質、多糖含量的影響，結果見圖1和圖2。

圖1 溫度對黏液質黏度的影響Fig.1 Effect of temperature on viscosity of mucilage

圖2 溫度對黏液質成分的影響Fig.2 Effect of temperature on contents of mucilage

由圖1、圖2可知，山藥黏液質的黏度、蛋白質和多糖含量均隨溫度的上升而下降，而多糖含量隨溫度以一種緩慢的趨勢下降，三者的含量在30～50℃的下降速度均較緩慢。這一現象可以解釋為，隨著溫度增加，聚合物分子熱運動加劇，分子間締合的氫鍵發生斷裂，從而使黏度下降，而多糖和蛋白質含量的降低，可能與黏液中懸浮的非水溶性(或熱變性形成的聚合物)部分沉淀有關。在50～100℃，由于蛋白質發生熱變性，蛋白質含量急劇下降，多糖含量也緩慢下降，多糖-蛋白質的結構受到破壞，黏度下降速度加快。因此，山藥黏液質的黏度與蛋白質、多糖含量呈正相關的關系。

圖3顯示，在30～50℃，山藥黏液質的還原力及對DPPH·、O2-·的清除率變化趨勢平緩，說明在此溫度范圍內，黏液質的性質較穩定，溫度對其活性影響較小;而在50～100℃過程中，其抗氧化活性下降速率加劇，與黏度、蛋白質含量的變化趨勢相似，說明隨著溫度升高，黏液質中多糖-蛋白質結構受到破壞，活性也隨之降低。因此，從保持黏液質活性角度來說，加工處理過程的溫度不宜高于50℃。

圖3 溫度對黏液質抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of temperature on antioxidant activity of mucilage

2.2 酶種類的選擇

根據山藥黏液質固形物中蛋白質占25.02%和總糖占 67.79% 這一特點，以及王常青［13］、Takao［14］等人的試驗結論，選用多種以這2類物質為底物的水解酶對黏液質進行酶解，其對黏液質黏度的影響如圖4所示。

圖4 酶種類對山藥黏液質黏度的影響Fig.4 Effect of kinds of enzymes on viscosity of yam mucilage

由圖4可知，所選酶中，以纖維素酶和甘露聚糖酶的酶解對黏液質黏度影響最大。黏液質經纖維素酶、甘露聚糖酶酶解后，黏度由28.16 mPa·s分別下降到19.51、20.17 mPa·s。甘露聚糖酶酶解能使黏液質黏度明顯下降，主要原因是這種酶作用的底物甘露聚糖是山藥黏液質多糖中的主要成分;而纖維酶是一種多酶制，除能水解葡聚糖中β-1，4糖苷鍵的多酶制劑外，對黏液質中的木聚糖、可溶性纖維素等也有降解作用，使多糖分子量降低，從而降低體系黏度。所以，選擇纖維素酶、甘露聚糖酶兩種酶進行復配酶解試驗，以進一步降低黏液質的黏度。

2.3 復合酶解的單因素試驗

2.3.1 酶解溫度對黏液質黏度的影響

固定加酶量0.4%，纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，反應時間70 min，考察酶解溫度對黏液質黏度的影響，結果如圖5所示。

圖5 反應溫度對山藥黏液質黏度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on viscosity of yam mucilage

由圖5可見，在30～70℃黏液質黏度呈持續下降趨勢，而沒有表現出一般溫度對酶反應影響的最適溫度行為。原因是，在60℃以前，酶活力隨溫度(朝最適溫度方向)上升而增強，對黏液質的降解程度也增大，從而使黏度也隨之逐漸下降;而溫度上升到60℃時，樣品中開始出現少量絮狀物，到達70℃時，則有大量白色絮狀沉淀，離心后樣品液澄清透明，黏度產生不可逆性下降［13］，黏液質中蛋白質變性絮凝。因此，結合溫度對黏液質影響結果(圖2和圖3)的討論，選擇試驗溫度為50℃。

2.3.2 復合酶配比對黏液質黏度的影響

固定加酶量0.4%，反應時間70 min，酶解溫度50℃，考察纖維素酶與甘露聚糖酶不同配比對黏液質黏度的影響，結果如圖6所示。

圖6 纖維素酶/甘露聚糖酶對山藥黏液質黏度的影響Fig.6 Effect of Celluse/Mannase on viscosity of yam mucilage

由圖6可看出，酶解液黏度隨纖維素酶-甘露聚糖酶復合配比表現出一種先下降再升高的趨勢，纖維素酶-甘露聚糖酶配比為3∶1時，黏度下降最明顯，由26.81 mPa·s降至14.69 mPa·s。過此配比點后，隨著甘露聚糖酶在復合酶中比例的增加，黏度下降程度逐漸減少。出現這種趨勢的可能原因是，加入的甘露聚糖酶為專一性酶，僅對甘露聚糖β-1，4糖苷鍵作用，添加量易達到飽和狀態;而纖維素酶可降解多種糖分結構，其添加比例的減少，會影響對某些成分的降解，從而影響黏度下降。因此，優化試驗時，纖維素酶-甘露聚糖酶復合酶配比條件可圍繞3∶1選擇。

2.3.3 加酶量對粘液質黏度的影響

固定纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，反應70 min，酶解溫度50℃，以不同復合酶添加量進行試驗，得到的結果如圖7所示。

圖7 酶添加量對山藥粘液質黏度的影響Fig.7 Effect of the amount of enzyme on viscosity of yam mucilage

由圖7可知，隨著加酶量的增加，山藥黏液質黏度呈現前面下降較快，后面下降趨緩的模式。這種黏度下降快慢模式的變化，出現在0.4% ～0.6%。因此，將加酶量控制在一定范圍內，可能提高酶解過程酶的效力。從經濟效益和酶解效果角度考慮，選擇加酶量0.4%、0.5%、0.6%作為正交試驗的3水平。

2.3.4 反應時間對黏液質黏度的影響

固定加酶量0.4%，纖維素酶與甘露聚糖酶配比為3∶1，酶解溫度50℃，考察酶解反應時間對黏液質黏度的影響，結果如圖8所示。

由圖8可知，酶解時間對山藥黏液質的黏度影響也呈現非線性的下降模式，前期黏度下降較快，后期黏度下降速度趨緩，在80 min處出現轉折。這是因為剛開始酶解時，底物濃度高，酶催化底物反應速度也快，但底物濃度隨著酶解的進行而下降，從而使得酶反應速度也下降。因此，正交試驗的酶解時間可選擇80 min左右。

2.4 復合酶解的正交試驗

表1為采用L9(34)正交表設計的實驗因素水平表，實驗結果如表2所示。

圖8 反應時間對山藥黏液質黏度的影響Fig.8 Effect of hydrolysis time on viscosity of yam mucilage

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal array design

表2 正交實驗結果Table 2 Results of the L9(34)orthogonal array design

由表2可以看出，影響黏度的主次因素為B＞C＞A。表3的方差分析也表明，酶添加量對黏度影響較為顯著。根據實驗結果分析，選擇的最優因素水平為:A2B3C3，即復合酶配比為2∶1，酶添加量為0.6%，反應時間90 min。按照1.2.4的方法，根據1.2.6實驗得到的酶解優化條件，對山藥黏液質進行酶解，3次重復實驗結果表明，山藥黏液質黏度由酶解前的26.09 mPa·s，降至 9.18 mPa·s，降低了 64.81%，效果顯著。

從總的效果來看，酶解使山藥黏液質黏度降低的效果明顯，有利于噴霧干燥前的預濃縮。

表3 正交實驗方差分析Table 3 Variance analisis of orthogonal array design

3 結論

山藥黏液質黏度及生物活性與溫度有較大關系，超過60℃，黏液質黏度會因出現明顯渾濁沉淀物而下降，同時抗氧化活性也隨之大大下降。由纖維素酶和甘露聚糖酶以2∶1配成的復合酶，在酶添加量0.6%、反應90 min、50℃的優化條件下，對山藥黏液質時行酶解，可使山藥黏液質的黏度降低近65%。主要原因是所選的纖維素酶、甘露聚糖酶可作用于粘液質中多糖的糖苷鍵，將鏈長而復雜的多糖降解，降低其分子量，從而降低黏度［19］。該方法具有促成實現黏液質先預濃縮再噴霧干燥工藝的潛力。

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