褶皺假絲酵母產脂肪酶條件及酶學性質研究

張玉芳，單守水

（1.煙臺汽車工程職業學院，山東煙臺265500；2.煙臺大學，山東煙臺264005）

脂肪酶能在非水介質中催化如三酰甘油酯等水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化以及酯類的逆向合成反應，成為一種應用最為廣泛的酶類之一[1]。脂肪酶來源廣泛，其中利用微生物的生長代謝積累脂肪酶，不僅成本低、易于工業化生產，而且所得到的脂肪酶制劑產品比動植物來源的同類產品具有更好的應用性，比如有著更好的pH、溫度適應性，所以成為工業脂肪酶的重要來源[2]。目前研究報道的可以生產脂肪酶微生物大約65個屬，其中細菌28個屬、放線菌4個屬、酵母菌10個屬、其他真菌23個屬[3]。隨著微生物資源開發的深入以及基因工程技術手段的應用，還會有望不斷挖掘和改造出新的、產脂肪酶性能更好的微生物菌種。

海洋中生物多樣性溫藏著豐富的微生物資源，尤其由于海洋與陸地環境的巨大差異，人們希望從中找到更優秀的產酶微生物并開發利用。本論文以本實驗室從海洋中篩選出的一株產脂肪酶的褶皺假絲酵母為菌種，對其產脂肪酶條件及所產酶的酶學性質進行了較系統研究，為進一步開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究菌種

褶皺假絲酵母，本實驗室從海洋中篩選并保藏。

1.2 培養基配制

種子斜面培養基（g/L）：無水葡萄糖20，牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物5，瓊脂粉20；

種子擴培培養基（g/L）：牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物 5，橄欖油 5，K2HPO42，MgSO40.5；

產酶發酵培養基（g/L）：蔗糖 5，橄欖油 5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 1，（NH4）2SO430，pH=7.0；

培養基滅菌：121℃、30 min。

1.3 菌株的活化

將實驗室休眠的假絲酵母取出，斜面培養基28℃、72 h活化培養。

1.4 菌種擴培

將活化好的斜面菌種接種到50 mL/250 mL的三角瓶種子培養基中，于30℃，200 r/min振蕩培養30 h。檢查正常、待用。

1.5 產酶發酵

按10%的接種量接入到100 mL/500 mL三角瓶發酵培養基中，于30℃，200 r/min進行產酶發酵，定時取樣，測定菌體生物量，離心取上清液測定脂肪酶的活力。

1.6 粗酶制備

硫酸銨鹽析法制得脂肪酶粗品。

1.7 脂肪酶活力測定

采用橄欖油乳化法[4]，40℃，pH7.5條件下每分鐘催化產生1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個酶活單位。

1.8 菌體生物量測定

發酵液 1500 r/min離心，菌體用10 mL去離子水懸浮，以去離子水為空白對照，用分光光度計在560 nm測定發酵液的吸光度OD560。

2 結果與討論

2.1 菌體生長與產酶動力學曲線

圖1為假絲酵母的細胞生長和產酶動力學曲線。

圖1 假絲酵母的生長曲線和產酶曲線Fig.1 Growth and enzyme production curve of Candida rugosa

從圖1中看出，細胞從24 h開始進入對數生長期，36 h以后轉入生長穩定期。脂肪酶活力隨著生物量的增加而增加，細胞進入穩定期后酶活力達到最高，此后隨培養時間延長有所下降。

2.2 假絲酵母產酶條件優化

2.2.1 pH對產酶的影響

圖2為不同pH對產酶效果的影響。可以看出，當pH為7.0時，發酵液酶活力相對較高，酸性和堿性環境不適合假絲酵母產酶。

圖2 pH對產酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on enzyme production

2.2.2 發酵溫度對產酶量的影響

圖3是不同發酵溫度對產酶效果的影響。

圖3 培養溫度對產酶的影響Fig.3 Effect of temperature on lipase production

如圖3所示，30℃時假絲酵母產酶量明顯高于其他溫度條件下的產酶量。說明溫度對產酶效果影響顯著。

2.2.3 接種比例對產酶的影響

圖4是不同接種量對產酶效果的影響。

圖4 接種量對產酶的影響Fig.4 Effect of inoculation level on lipase production

從中看出，接種量對產酶量有明顯影響。實驗結果說明，接種量10%時發酵產酶活力較高。

2.2.4 發酵培養基組成對產酶的影響

針對三種碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖）的影響研究結果見表1所示。

以5 g/L蔗糖為碳源，不同類氮源（牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨）對假絲酵母產酶的影響，結果見表2所示。

表1 不同碳源及用量對產酶的影響Table 1 The effect of different and consumption carbon source on lipase production

表2 不同氮源及用量對脂肪酶產生的影響Table 2 The effect of different and consumption nitrogen source on lipase production

表1實驗結果所示，以蔗糖或淀粉為碳源發酵產生的脂肪酶活相比最高，葡萄糖最差。這與有關文獻的結果相同[5-6]。表2結果顯示，無機氮比有機氮更加顯著地有利于假絲酵母產酶，假絲酵母產酶選擇硫酸銨為宜。

2.2.5 振蕩頻率對產酶的影響

以5 g/L蔗糖、10 g/L硫酸銨為碳、氮源，研究不同的震蕩頻率對不同發酵濃度下產酶量的影響，實驗結果見圖5所示。提高震蕩頻率可以提高發酵液中溶氧量，從而提高產酶量。

圖5 震蕩頻率對產酶的影響Fig.5 Effect of shaking frequency on lipase production

根據上述實驗結果，確定褶皺假絲酵母發酵產脂肪酶的較優條件為：蔗糖5 g/L，橄欖油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L，起始 pH為7.0，接種量10%，在30℃、200 r/min下培養 36 h，產酶能力達到 4351.6 U/mL。

2.3 假絲酵母脂肪酶的酶學性質

2.3.1 酶作用的最適溫度

在不同溫度下測定褶皺假絲酵母脂肪酶粗品的活力，結果如圖6所示。

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Relationship between temperature and enzyme activity

酶作用最適溫度為30℃～40℃，超出這一溫度范圍，酶活力迅速下降。

2.3.2 酶作用的最適pH

按照酶活力測定方法，于37℃測定相同酶液在不同pH條件下的酶活力。結果如圖7所示。

圖7 pH對酶活力的影響Fig.7 Relationship between pH and enzyme activity

此酶的最適作用pH為7.5，在pH 7.3～7.7范圍內比較穩定。

2.3.3 金屬離子對酶活的影響

在酶測定體系中加入不同濃度的金屬離子，37℃和pH 7.5條件下保持1 h后測定酶的殘留活力，以原始酶活為100%，結果如表3所示。

表3 金屬離子對酶活的影響Table 3 The effect of metal ion on enzyme activity

幾種金屬離子中，Ca2+、Mg2+對酶活有一定的促進作用，隨著Ca2+濃度的增大，酶活先升后降；而Na+對酶有一定抑制作用。

3 結論

1）褶皺假絲酵母的最優產酶條件

發酵培養基：濃度45%（蔗糖5 g/L，橄欖油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L；

培養條件為：接種量 10%，pH7.0，培養溫度為30℃，200 r/min，發酵36 h，脂肪酶活力可達到4351.6g/L。

2）褶皺假絲酵母產脂肪酶的動力學特性

褶皺假絲酵母產脂肪酶在33℃～38℃，pH 7.4～7.6范圍內穩定，最佳反應條件為37℃、pH 7.5；Ca2+、Mg2+對酶活有一定的促進作用，而Na+對酶有一定抑制作用。

3）金屬離子對褶皺假絲酵母產脂肪酶活性影響

在幾種金屬離子中，適量Ca2++對酶活有一定的促進作用，而Na+對酶有一定抑制作用。

[1] 張樹政．酶制劑工業(下冊)[M].北京：科學出版社,1984：655-670

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