培養基組成對布拉氏酵母生長的影響及其優化

杜曉蒙，陶如玉，圣志存，賈士儒

（教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津科技大學，天津300457）

布拉氏酵母是法國科學家HenriBoulard于1923年從印尼水果荔枝中分離得到的一株適溫、非毒性酵母菌株，一般認為是釀酒酵母的亞種[1]。目前布拉氏酵母廣泛用于預防和治療各種腹瀉、腸道炎癥[1-2]。藥代動力學研究顯示，連續口服之后，布拉氏酵母能夠在結腸內穩定存在3天左右，停藥之后則會隨糞便排出，不會在腸道內定植[3-4]。另外，使用細菌作為益生菌的最大危險是其可能會將耐藥基因傳給致病菌，而酵母不存在此類問題，是安全的微生態調節劑[5]。在許多國家，布拉氏酵母作為凍干產品用于預防兒童和成人的腹瀉[2，6]。此外，布拉氏酵母制劑還能夠增強微生態平衡，刺激免疫系統，作為飼料添加劑的應用已得到包括中國在內的許多國家的認可，因此在畜牧業中必將有廣闊的應用前景[7-10]。

作為微生態制劑，要保證其生物療效，腸道內必須達到足夠數量的活菌數，因此本文以布拉氏酵母菌為菌株，研究了不同培養基成分、培養條件對其生物量積累的影響，初步確定最有利于菌體生長的培養條件，之后利用正交試驗確定益生菌布拉氏酵母的最適搖瓶培養條件[11]，為其活菌制劑的生產制備提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

布拉氏酵母菌由天津科技大學生化工程研究室分離篩選。

1.1.2 培養基

種子培養基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，pH5.0；初始發酵培養基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH5.0。

1.2 方法

1.2.1 培養過程及生物量測定

挑取布拉氏酵母接種至種子培養基中，30℃，200 r/min振蕩培養12 h后，以7%接種至發酵培養基中，振蕩培養24 h，取樣測其生物量及殘糖含量[12]。

1.2.2 單因素試驗

分別以碳源種類、氮源種類、磷酸二氫鉀濃度、硫酸鎂濃度為影響因素進行實驗，以菌體量、光密度為指標研究各因素對菌體生長的影響及其最適水平。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，以葡萄糖、酵母膏、磷酸二氫鉀及硫酸鎂濃度為考察因素，以布拉氏酵母菌體干重（DCW）為考察指標，進行L16（44）正交試驗，研究各因素對酵母生長的影響[13]，因素水平表如表1所示，共16個實驗組。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 培養條件對酵母生長的影響

在正交試驗結果基礎上，研究接種量和培養基初始pH對酵母生物量的影響，實驗步驟同1.2.1。

2 結果與討論

2.1 布拉氏酵母生長曲線

利用Bioscreen全自動生長曲線測定儀繪制布拉氏酵母生長曲線[14]，結果如圖1所示，接種后0～4 h處于延滯期，4 h～24 h為對數生長期，24 h之后進入穩定期。因此試驗過程中種子液的培養時間選擇對數期12 h，發酵培養時間 24 h[15]。

2.2 培養基組成對布拉氏酵母生長的影響

2.2.1 碳源種類對酵母生長的影響

試驗結果如圖2所示，以麥芽糖為碳源時酵母生物量最高，比葡萄糖組高9.4%；乳糖組生物量最低，其原因可能在于布拉氏酵母菌降解或發酵乳糖的能力較差[14]。鑒于蔗糖成本高于葡萄糖，而且葡萄糖是最容易利用的碳源之一[15]，因此綜合考慮，選擇葡萄糖為碳源較為適宜。

圖1 布拉氏酵母生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces boulardii

圖2 碳源種類對布拉氏酵母生物量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on the biomass

2.2.2 氮源種類對酵母生長的影響

氮源種類對布拉氏酵母生長的影響見圖3。

圖3 氮源種類對布拉氏酵母生物量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on biomass

無機氮源對布拉氏酵母生物量的影響相差不大，菌體量都很低，耗糖很少；而有機氮源組的生物量比無機氮源組高出三倍以上，葡萄糖幾乎全部耗完，其中以酵母膏的效果最好，其原因在于酵母膏含豐富的蛋白質、多肽和游離氨基酸以及維生素、生長因子等[15]，因此它能夠使布拉氏酵母迅速繁殖，后續試驗選擇酵母膏為培養基氮源。

2.2.3 磷酸二氫鉀濃度對酵母生長的影響

磷是蛋白質和核酸的必要成分，也是三磷酸腺苷ATP的組成成分，因此磷元素的含量對微生物的生長也有一定影響[15]。試驗結果如圖4，磷酸二氫鉀濃度為0.8 g/L時，酵母生物量最大，之后隨濃度上升生物量開始降低。

圖4 磷酸二氫鉀濃度對布拉氏酵母生物量的影響Fig.4 Effect of Potassium Phosphate Monobasic concentration on the biomass

2.2.4 硫酸鎂濃度對酵母生長的影響

鎂處于離子狀態時，是許多重要酶的激活劑，也是發酵過程中不可缺少的成分[15]。硫酸鎂濃度對布拉氏酵母生物量的影響如圖5。

圖5 硫酸鎂濃度對布拉氏酵母生物量的影響Fig.5 The effect of magnesium sulfate heptahydrate concentration on the biomass

由圖5所示，添加鎂離子對布拉氏酵母的生長有一定的促進作用，當其濃度為0.05%時，菌體生物量最大，因此初步確定培養基中硫酸鎂濃度為0.5 g/L。

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果如表2。四個影響因素對布拉氏酵母生物量的影響大小順序為A＞B＞D＞C，即葡萄糖濃度的高低是布拉氏酵母生長最重要的調控因子[17]，硫酸鎂濃度影響最小。

發酵培養基的方差分析見表3，結果表明，四個影響因素中，葡萄糖和酵母膏濃度對布拉氏酵母生物量均有顯著性影響。綜合表2和表3確定培養基的優方案為A4B3C2D2，即布拉氏酵母培養基組成為葡萄糖45g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L和硫酸鎂0.5 g/L，此時布拉氏酵母菌體干重為6.3 g/L。

表2 L16（44）正交試驗結果分析Table 2The results and analysis of the L16（44）orthogonal test

表3 發酵培養基的方差分析表Table 3 Variance analysis of fermentation media

2.4 培養條件對酵母生長的影響

2.4.1 pH對酵母生長的影響

培養基的pH會影響菌體對營養物質的吸收和代謝產物的分泌，還會影響培養基中某些營養物質的分解[15]，因此pH是影響微生物生長極為重要的環境因子。圖6顯示，發酵培養基初始pH5.5時酵母生物量最大，pH偏高或偏低均不利于布拉氏酵母的生長。

2.4.2 接種量對酵母生長的影響

圖6 培養基初始pH對菌體生長的影響Fig.6 The effect of initial pH on the biomass of S.boulardii

圖7 接種量對菌體生長的影響Fig.7 The effect of incubation size on the biomass of S.boulardii

接種量對酵母生長的影響由圖7所示，種子液接種量為9%時生物量達到最大值，增大或減小接種量其生物量均有所降低。研究表明，接種量過多，培養液黏度增加，造成溶氧不足，反而會影響菌體生長；接種量過小則會延長發酵周期，并且容易染菌[15]。因此培養過程取接種量為9%，在此條件下培養布拉氏酵母24 h后其細胞干重為6.5 g/L。

3 結論

本研究確定了搖瓶培養布拉氏酵母的培養條件為葡萄糖45 g/L，酵母膏12 g/L，磷酸二氫鉀0.8 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，初始pH5.5，接種量9%。在此條件下，30℃，200 r/min振蕩培養24 h后細胞干重達到6.5 g/L，對于益生菌布拉氏酵母在畜牧業、醫藥等領域的應用具有實際意義。

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