纖維素酶及耐高溫淀粉酶提取柑橘皮果膠的研究

王文文，李靜，鄧毛程，湯敬謙，張東峰

（1.廣東輕工職業技術學院，廣東廣州510300；2.廣東高校特色調味品工程技術開發中心，廣東廣州510300；3.暨南大學圖書館，廣東廣州510632）

果膠是一種高分子碳水化合物，是細胞壁的一種組成成分，廣泛存在于植物的果實、根、莖、葉中。由于果膠是天然提取物，無毒無害，安全可靠，所以經常作為膠凝劑、增稠劑、穩定劑、乳化劑、組織改良劑等天然食品添加劑應用在食品及化工工業中[1]。此外，由于果膠具有抗菌、止血、消腫、解毒、止瀉、降血壓、抗輻射等作用，近年來，其在醫藥領域的應用也較為廣泛[2-3]。隨著功能性多糖的開發研究，果膠作為水溶性膳食纖維，越來越受到研究和加工行業的重視。

柑橘為我國著名果品之一，柑橘皮中果膠含量約占20%～30%。從柑橘皮中提取的果膠是高酯化度的果膠，酯化度在70%以上，提取的果膠不僅安全優質而且是對柑橘皮的“廢物利用”，不僅可解決廢物處理問題，還可提高柑橘生產加工的經濟效益，是柑橘綜合利用的很好途徑[4-6]。

據目前文獻報道，果膠提取方法多為單純酸水解法或單純酶法提取[1]，綜合運用雙酶法提取鮮見報道。因此本研究對纖維素酶及耐高溫淀粉酶輔助提取柑橘皮果膠工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

柑橘皮粉：柑橘購自水果市場，剝下柑橘皮曬干，干柑橘皮用粉碎機粉碎，過100目篩，得柑橘皮粉。

纖維素酶購自南寧龐博生物工程公司，酶活力為 10000 U/g；耐高溫淀粉酶購自諾維信公司，酶活力為 20000 U/g。

咔唑試劑，無水乙醇，半乳糖醛酸，氫氧化鈉，濃鹽酸，濃硫酸均為分析純。

1.2 主要儀器和設備

DMF-10A型搖擺式高速中藥粉碎機：廣州市旭郎機械設備有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；S22PC型分光光度計：上海凌光技術有限公司；中佳-SC-3614低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；BSA-224S-CW電子分析天平：北京塞多利斯天平有限公司；PHS-3C雷磁酸度計：上海雷磁儀器廠，玻璃比色皿等。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將鮮柑橘皮自然風干，切碎片，旋風式微型高速樣品粉碎機粉碎，過100目篩，備用。

1.3.2 酶量對柑橘皮果膠提取的影響

配制料液比為1∶15的果膠液，在pH 4.8，溫度50 ℃條件下，按照 10、20、30、40、50 U/g的量分別加入纖維素酶和耐高溫淀粉，酶解3.0 h，確定最佳酶量。

1.3.3 時間對復合酶提取柑橘皮果膠的影響

配制料液比為1∶15的果膠液，在上述優化的最佳酶使用量下，調pH4.8，溫度50℃酶解不同時間，確定最佳作用時間。

1.3.4 pH對復合酶提取柑橘皮果膠的影響

配制料液比為1∶15的果膠液，在上述優化的酶加量下及時間下，溫度50℃，調不同pH，確定最佳pH。

1.3.5 溫度對復合酶提取柑橘皮果膠的影響

配制料液比為1∶15的果膠液，在上述優化的酶加量、時間及溫度下，設置不同溫度，確定最佳溫度。

1.3.6 正交試驗設計

以單因素試驗結果為基礎，選出提取加酶量、pH、提取時間、溫度4個因素，設計L9（34）正交試驗進行試驗，確定復合酶的最佳提取工藝條件，試驗設計見表1。

表1 優化提取因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction

1.3.7 柑橘皮果膠提取率測定

1.3.7.1 果膠咔唑比色法測定

果膠經水解生成半乳糖醛酸，在強酸中與咔唑試劑發生縮合反應，生成紫紅色化合物，其呈色強度與半乳糖醛酸含量成正比[7]。參考文獻[8]的方法，以半乳糖醛酸標準品為標樣制備標準曲線，咔唑-硫酸分光光度法測定。測定標準曲線方程為：A=0. 0068C+0.007

式中：A為吸光值；C為半乳糖醛酸濃度，（μg/mL），r=0. 9988。

1.3.7.2 柑橘皮果膠粗提率

果膠粗提取率（%）=柑橘皮果膠的質量（以半乳糖醛酸計，g）/原料的質量（g）× 100%

2 結果與分析

2.1 復合酶加量對柑橘皮果膠提取的影響

復合酶使用量是提取過程中的重要因素，酶量過多或過少都會影響提取效果。酶加量對復合酶提取柑橘皮果膠的影響見圖1。

圖1 酶加量對復合酶提取果膠的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the compound enzyme extraction rate of pectin

由圖1可知，在一定范圍內，隨著加酶量的提高，果膠的提取率逐漸增高，但超過一定用量后，即使再增加酶用量，果膠提取率變化不大。這是由于酶有最佳作用濃度，超過濃度，只會增加生產成本，因此確定加酶量為40 U/g。

2.2 pH對復合酶提取柑橘皮果膠的影響

根據2.1的結果，確定加酶量40 U/g，溫度45℃，時間3.0 h，研究不同pH對復合酶提取柑橘皮果膠的影響。pH對復合酶提取柑橘皮果膠的影響見圖2。

圖2 pH對復合酶提取果膠的影響Fig.2 Effect of pH on the compound enzyme extraction rate of pectin

結果表明（如圖2所示），在pH低于5時，隨著pH的增加，果膠提取率逐漸增加，但pH超過5，果膠提取率開始下降，這主要是pH影響了酶發揮作用，因此確定復合酶的最佳pH為5。

2.3 溫度對復合酶提取柑橘皮果膠的影響

根據2.1及2.2的結果，確定加酶量40 U/g，pH 5，時間3.0 h，研究不同處理溫度對復合酶提取柑橘皮果膠的影響。溫度對復合酶提取柑橘皮果膠的影響見圖3。

圖3 溫度對復合酶提取果膠的影響Fig.3 Effect of temperature on the compound enzyme extraction rate of pectin

由圖3可知，溫度為50℃時，提取效果最佳。溫度低于或高于50℃都會降低復合酶的提取效率，溫度過高，會抑制酶活，甚至破壞酶結構，溫度過低，不能使酶發揮最大活力效應，從而使提取效果下降。

2.4 時間對復合酶酶提取柑橘皮果膠的影響

根據上述結果，確定加酶量40 U/g，pH 5，溫度50℃。研究不同時間對復合酶提取柑橘皮果膠的影響。時間對復合酶提取柑橘皮果膠的影響見圖4。

圖4 時間對復合酶提取果膠的影響Fig.4 Effect of time on the compound enzyme extraction rate of pectin

圖4結果表明，時間3.0 h時果膠提取率最高。當處理時間低于3.0 h時，復合酶的活力沒有得到充分利用，果膠不能很好的溶出，當時間高于3 h，果膠提取率反而降低，可能因為酶活降低，以及果膠結構發生變化所致，故3.0 h為最佳的提取時間。

以單因素試驗結果為基礎，選出提取加酶量、pH、提取時間、溫度4個因素，設計L9（34）正交試驗進行試驗。復合酶提取柑橘皮果膠正交試驗結果見表2和表3。

由表2和表3可以看出，影響因素依次為B＞D＞A＞C，即B在0.05水平下顯著。由此確定最佳提取工藝為：A3B2C1D3，即在料液比為 1∶15 時，酶用量為 45 U/g，處理時間3.0 h，提取溫度為55℃，pH為4.8。在最佳條件下進行驗證試驗3次平均提取率為36.48%。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis on the results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析表Table 3 The results of variance analysis for orthogonal experiment

3 結論

本研究的主要目的是對現有的柑橘皮果膠提取各工藝進行改進以提高柑橘果膠的提取率和產品質量。其改進主要表現在以下兩個方面：（1）在提取之前對柑橘皮原料進行粉碎處理，以增加酶作用面積。（2）纖維素酶酶解提取與耐高溫淀粉酶酶解提取綜合運用，以增加提取率和提取純度。

采用纖維素酶與耐高溫淀粉酶對柑橘皮果膠進行提取，選用料液比為1∶15，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，確定最佳提取工藝條件為：復合酶量45 U/g，時間 3.0 h，溫度 55℃，pH 為 4.8，在此條件下，柑橘皮果膠提取率可達36.48%。

[1] 田輝,馬力.果膠制備方法的研究進展[J].中國調味品,2007,32(3)：17-20

[2]CHAN DC,BARRETT PHR,WATTS GF.Lipoprotein transport in the metabolic syndrome：methodological aspects of stable isotope kinetic studies[J].Clinical Science,2004,107：221-232

[3]RIDEOUT TC,YUAN Z,BAKOVIC M,et al.Guar gum consumption increases hepatic nuclear SREBP2 and LDL receptor expression in pigs fed an atherogenic diet[J].The Journal of Nutrition,2007,137：568-572

[4] 姜少娟,劉曉莉.橘皮果膠的超聲提取研究[J].中國釀造,2010,29(12)：151-154

[5] 何金明,肖艷輝,藍俊興.橘皮果膠提取條件的研究[J].保鮮與加工,2008(1)：46-48

[6] 汪海波,汪芳安,潘從道．柑橘皮果膠的改進提取工藝研究[J]．食品科學,2007,28(2)：136-141

[7] Pinheiro EP,silvaI MAD,Gonzaga LV,et al.Optimization of extraction of high-ester pectin from passion fruit peel(Passiflora edulis flavicarpa)with citric acid by using response surface methodology[J].Bioresource Technology,2008,99(13)：5561-5566

[8] 李春明,管春梅.咔唑比色法測定玉米種皮中的果膠含量[J].中國公共衛生,2004,20(4)：490