舌鱗狀細胞癌細胞與正常黏膜細胞微泡的差異蛋白組學研究

韓新生 張卓遠 黃怡 夏翼超 李龍江

1.南充市中心醫院口腔科，南充 637000；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院頭頸腫瘤外科（四川大學），成都 610041

微泡（exosome，EXO）又稱外泌小體，是指由脂質膜所包裹的直徑為40～100 nm的膜性囊泡[1]。EXO內含有豐富的mRNA、miRNA、蛋白質分子及脂質分子[2-3]，其內容物的種類和數量取決于來源的細胞種類。多數類型的活細胞都可以分泌產生EXO，其中包括腫瘤細胞。EXO在各種生理和病理過程中起著非常重要的作用。近年來，在腫瘤細胞分泌EXO與腫瘤生長、侵襲，腫瘤的血管生成、免疫調節以及信息交流傳遞等方面進行了大量研究[4-7]，結果認為，腫瘤細胞的EXO可成為腫瘤細胞的使者，在腫瘤物質和信息的傳遞方面起著非常重要的作用。然而，目前尚不清楚不同惡性腫瘤細胞外泌的EXO內可能的惡性物質及其功能情況，尤其是關于口腔癌細胞來源的EXO的研究較少。本文采用差異蛋白組學方法，分析舌鱗狀細胞癌細胞與正常黏膜細胞EXO內蛋白質的表達情況，為研究舌鱗狀細胞癌復發、轉移、擴散機制提供分子生物學依據。

1 材料和方法

1.1 細胞株

舌鱗狀細胞癌細胞Tca8113購自中國科學院細胞研究所，人永生化口腔黏膜上皮細胞HOK由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室惠贈。

1.2 主要儀器和試劑

Leica TCS SP2型激光共聚焦掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（德國萊卡公司），SJM-300型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（日本電子株式會社），CP70 MX型冷凍高速離心機（日本日立公司），BIORAD450型酶聯免疫檢測儀（美國伯樂公司），穩壓電泳系統（美國伯樂公司），DU530型核酸/蛋白分析儀（美國貝克曼公司），IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT six大型垂直電泳系統（美國通用電氣公司），Ultraflex Ⅲ質譜儀（美國布魯克公司）；蔗糖、重水（D2O）、硫脲、除高峰度蛋白質試劑盒、碳酸鈉、碳酸氫鈉（Sigma公司，美國），DMEM高糖細胞培養基、角質細胞無血清培養基（defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM）（Gibco公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰蛋白酶、鼠抗人主要組織相容性復合體Ⅰ類分子（major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC-Ⅰ）單克隆抗體、鼠抗人熱休克蛋白-70（heat shock protein-70，HSP-70）單克隆抗體（Santa公司，美國），辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG結合物（武漢博士德生物工程有限公司）；Image Scanner掃描儀和LabScan軟件，低熔點瓊脂糖、固相pH值干膠條、蛋白質純化試劑盒、定量試劑盒、考馬斯亮藍[安瑪西亞生物技術（上海）有限公司]。

1.3 細胞培養及EXO的分離純化和鑒定

1.3.1 細胞株的復蘇、傳代、培養 Tca8113細胞常規培養于含10% FBS的DMEM高糖培養基中，HOK細胞株用專用的DK-SFM無血清培養基于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。根據細胞生長密度，一般每48 h換液1次。細胞傳代：當細胞匯合程度達80%～90%時，細胞達到對數生長期，胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。

1.3.2 細胞上清液的收集 為避免血清中EXO污染，將在含血清培養基中擴增的Tca8113按細胞密度為7×108個·mL-1接種到1 000 mL培養瓶，加無血清培養基200 mL，培養48 h后收集培養上清液；HOK細胞為無血清培養。將收集的上清液-20 ℃保存，到一定量后進行差速離心，以分離純化上清液中的EXO。

1.3.3 EXO的分離純化 將收集的細胞上清液在4 ℃下300 g離心5 min以去除死亡的細胞，再行2 000 g離心20 min，用直徑為0.22 μm的濾器過濾以去除細胞碎片，收集過濾后的上清液，10 000 g離心30 min，收集上清液，隨后110 000 g離心60 min得到沉淀的EXO，將沉淀的EXO重懸于5 mL PBS中，移至另一個底部裝有以重水為密度墊的離心管中，以110 000 g離心60 min，在重水層得到的就是純化的EXO[8]。將純化的EXO用50 μlPBS稀釋，將提純稀釋的EXO溶液裝入EP管內，放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 形態學觀察 TEM觀察：滴加30～40 μlEXO懸液于載樣銅網上，室溫靜置3 min，濾紙吸干，滴加2%的磷鎢酸溶液（pH=6.8）約20 μL于銅網上，室溫負染2 min，濾紙吸干負染液，烤干約15 min，滴網法TEM下觀察照相。SEM觀察：將細胞爬片用2.5%的戊二醛固定液在4 ℃冰箱內固定1 h，系列梯度乙醇脫水，每次 5 min，將樣本放入干燥儀內干燥約1.5 h，再將樣品導電處理，完成后鏡下觀察。

1.3.5 Western blot 將獲取的蛋白質樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳后通過半干印跡法轉移至聚偏氟乙烯膜上，室溫下將膜置于含質量分數5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液中封閉1 h，以阻斷非特異性背景染色；然后于4 ℃下加入特異性抗體過夜。洗滌后加入辣根過氧化酶偶聯多克隆抗體IgG共同孵育1 h。TTBS洗液中漂洗3次，最后在TBS中漂洗3 min，DAB顯色，最后曝光及洗片，用Bio-Rad圖像分析儀進行圖像掃描。本實驗使用的抗體及稀釋度分別為：鼠抗人MHC-Ⅰ單克隆抗體（1∶100）和鼠抗人HSP-70單克隆抗體（1∶100），內參一抗的終稀釋度為1∶500。

1.4 差異蛋白組學研究

1.4.1 EXO蛋白的純化 用蛋白質純化試劑盒進行EXO蛋白的純化。

1.4.2 EXO蛋白的定量 采用Bradford法測定EXO懸液中的蛋白質質量濃度。將樣本混勻，靜置10 min，每組樣本設3個復孔，放置在波長為595 nm的酶標儀中檢測吸光度值。

1.4.3 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 1）第一向等電聚焦電泳（isoelectric focusing electrophoresis，IEF）。將制備好的蛋白質樣品均勻涂布在膠條槽兩電極之間，避免產生間斷和氣泡，然后撕掉膠條保護膜，將IPG（immobilized pH gradient）梯度干膠條的膠面向下，把整個膠條緩緩地放入膠條槽中，每個IPG膠條上均勻涂覆覆蓋油以防止電泳時水分蒸發。電泳參數：30 V，12 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，0.5 h；10 000 V，10 h；500 V，12 h。2）第二向SDS-PAGE電泳。配制SDS-PAGE電泳緩沖液，然后配制瓊脂糖封膠液并加熱熔解。IPG膠條平衡方法如下：用平衡緩沖液進行兩次平衡，每次在軌道搖床上搖動15 min；將平衡好的膠條水平附在SDS-PAGE凝膠上緣，緩緩加入少量上槽電泳緩沖液，使上、下槽緩沖液處于電泳槽標定刻度間的同一水平面。電泳參數：74 V，161 mA，12 W，1 h；91 V，132 mA，12W，1 h；257 V，389 mA，100 W，1 h；410 V，244 mA，100 W，4 h。電泳后將所得凝膠進行考馬斯亮藍染色。

1.4.4 凝膠圖譜掃描和分析 用Image Scanner機器對凝膠圖像進行掃描，用Image Master V 5.0軟件對掃描圖譜進行分析。

1.4.5 串聯二級質譜（milli second/milli second，MS/MS）對差異點的分析 對獲得的電泳凝膠進行酶解和除鹽等一系列處理，然后利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀進行質譜分析。消化酶：胰酶；固定修飾：乙酰化，可變修飾：氧化；一級質量容差允許誤差范圍：±0.01%；二級片段質量公差允許誤差范圍：±0.7 g·mol-1；數據庫：美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）；種屬：人類。

2 結果

2.1 EXO的形態學觀察

經SEM和TEM觀察，均可見培養細胞分泌出大量的EXO；EXO呈現為圓形或類圓形的小體結構，大小不等，直徑為40～100 nm（圖1）。

2.2 EXO分子標志物的鑒定

以細胞全蛋白為陽性對照，以β-actin為內參，通過Western blot試驗，EXO在相對分子質量為7.3×104處檢測到HSP-70蛋白的表達，在4.0×104處有MHC-Ⅰ蛋白的表達。

圖1 Tca8113細胞表面外泌的EXO（左）及EXO的形態（右）Fig 1 EXO observed under SEM in Tca8113 cells surface (left) and EXO morphology observed under TEM (right)

2.3 差異蛋白組學實驗

2.3.1 EXO的定量分析 通過Bradford法測定每次分離制備的EXO懸液中的總蛋白含量，平均每毫升EXO懸液可獲得EXO（30.2±1.9）μg，質量范圍為28.3～32.1 μg，95%可信區間為27.5～33.4 μg。

2.3.2 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 通過第一向IEF聚焦和第二向SDS-PAGE電泳得到的分離電泳圖譜見圖2。將得到的凝膠圖譜進行考馬斯亮藍染色，通過Image Master V 5.0軟件進行掃描和自動分析，設定差異表達量在2倍及以上的點納入下一步實驗。本實驗共篩選納入16個差異點進行質譜學分析和鑒定，其中舌鱗狀細胞癌細胞EXO上調表達的有12個點，下調表達的有4個點。

圖2 對照組（HOK細胞，上）和實驗組（Tca8113細胞，下）EXO的電泳圖譜Fig 2 Electrophoretogram of EXO control group (HOK cells, top)and experimental group (Tca8113 cells, bottom)

2.4 MS/MS對差異點的分析

對所得16個差異表達點進行切膠、酶解、除鹽以及固定和可變修飾等，得到16個一級肽質量指紋圖譜，再對后者進行串聯二級質譜的MS/MS分析，得到16組肽段的MS/MS數據，使用Biotools軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎，搜索參數設置：數據庫為NCBI，檢索種屬為人類，在線檢索得到16個差異點的蛋白質名稱和NCBI 庫編號（表1）。分析表1可見，本研究出現了多個點鑒定為同一蛋白質的現象，其原因可能是由于體內同一蛋白有不同形式的修飾或剪切存在，從而形成相對分子質量和等電點不同的蛋白質，這些蛋白質在鑒定時會同時指向數據庫中全長無修飾的同一蛋白質。本研究結果發現，差異表達的蛋白質中有肌動蛋白、黏著斑蛋白、波形蛋白以及錨定蛋白Ⅰ等，此類蛋白是細胞骨架蛋白，它在EXO中存在說明EXO的內容物來自細胞質成分。EXO的形成首先是質膜內陷形成含有多個微囊泡的多囊體，然后多囊體與細胞膜融合分泌到細胞外形成EXO。錨定蛋白的存在驗證了質膜內陷、多囊體中各微囊泡的融合、多囊體和質膜融合釋放EXO這一過程。波形蛋白可能是維持EXO分泌到細胞微環境并保持穩定結構的重要物質。本研究得到了兩個有重要意義的差異表達蛋白即腫瘤拒絕抗原1（gp96）和K-sam蛋白。此外，本研究中檢索出了假想蛋白，這是目前結構和功能均未知，但在人體中確實存在的蛋白質，分析其結構可能對其功能的研究提供重要線索。

表1 16個差異蛋白點的MS/MS分析Tab 1 Sixteen differential points of MS/MS analysis

3 討論

本研究結果證實了Tca8113和HOK細胞株在體外培養的情況下可以分泌大量的具有囊泡狀結構的物質，這些物質經過EXO表面標志分子HSP-70和MHC-Ⅰ驗證，證實為細胞外分泌形成的EXO，這與其他文獻[9-11]報道一致。同時，本研究也證實，通過密度梯度離心法可以獲得較高純度的EXO，通過蛋白雙向電泳可以獲得分辨率和重復性較好的凝膠圖譜，蛋白質組學技術是快速、高通量獲取EXO蛋白質構成的有力方法[12]。

本研究發現，腫瘤拒絕抗原1（gp96）在舌鱗狀細胞癌細胞來源的EXO中表達上調。gp96屬于熱休克蛋白HSP-90家族成員。目前研究表明，gp96可以作為分子伴侶參與腫瘤抗原向MHC-Ⅰ類分子途徑的遞呈過程，并與抗原肽形成gp96肽復合物，激活CD8+T淋巴細胞，產生抗腫瘤的特異性免疫反應。此外，gp96還能不依賴于抗原肽激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號轉導，產生細胞因子和趨化因子，誘導樹突狀細胞成熟，通過上述多種作用調節非特異性免疫反應。gp96在舌鱗狀細胞癌細胞來源的EXO中表達上調，可以推斷出舌癌細胞可能通過分泌大量含有gp96的EXO從而排除自身的腫瘤抗原，進而使腫瘤逃避機體的免疫監視和免疫應答。這為進一步分離純化舌鱗狀細胞癌細胞來源的含有gp96的EXO，進而制備抗舌癌的疫苗提供了實驗支持[13]。

本研究還觀察到K-sam蛋白在舌鱗狀細胞癌細胞EXO中表達上調。K-sam蛋白又稱成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）蛋白，由K-sam基因編碼，K-sam基因是一種致癌基因，起初作為增殖基因從胃癌細胞株KATO-Ⅲ中分離得到[14]，在彌散性胃癌中增殖作用明顯。FGFR2與人類疾病密切相關，對癌癥的進展起到重要的促進作用[15]。目前研究發現，在口腔癌、肺癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌等腫瘤中均存在FGFR2的表達[16-19]。不少學者對FGFR2在口腔癌中的作用進行了研究，結果發現，在口腔鱗狀細胞癌中成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）及其受體FGFR，主要是FGFR2表達上調。Vairaktaris等[20]通過動物模型研究口腔癌從正常黏膜到黏膜細胞非典型增生再到口腔黏膜癌變的連續不同的階段，發現在口腔黏膜癌變的起始階段（從黏膜細胞非典型增生到早期浸潤癌），FGFR2和FGFR3表達量上調，這提示FGFR2在口腔黏膜癌變的起始階段有非常重要的作用。本研究同樣發現，FGFR2（K-sam蛋白）在舌鱗狀細胞癌細胞EXO中表達上調，可能是由于舌鱗狀細胞癌細胞釋放含有癌基因K-sam的EXO到細胞微環境中所致。筆者推測，這種EXO可以惡性轉化周圍的正常細胞，從而引起舌癌擴散、轉移、復發，這一推測需要后續研究來做進一步驗證。

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