量子點(diǎn)熒光探針檢測人舌鱗狀細(xì)胞癌荷瘤裸鼠模型早期下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究

李艷芬 陳坤

1.廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院口腔科，深圳 518023；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，湛江 524023

舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其主要的轉(zhuǎn)移方式。下頜下淋巴結(jié)常常是舌癌區(qū)域性淋巴結(jié)首要轉(zhuǎn)移（即前哨淋巴結(jié)）部位之一，如果能在術(shù)前或術(shù)中用微創(chuàng)方法將其送快速病理檢查，根據(jù)其性質(zhì)選擇舌癌手術(shù)方式，對提高患者的生存及生活質(zhì)量將有重要的意義。近年來，量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）熒光探針以其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其在腫瘤學(xué)的生物成像技術(shù)研究中顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。國外已有將QDs運(yùn)用于腫瘤的活體成像和前哨淋巴結(jié)成像[1-2]，國內(nèi)的相關(guān)研究還較少。本研究通過建立人舌癌荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，用QDs標(biāo)記的特異性角蛋白抗體QDs605-CK（AE1/AE3）熒光探針檢測荷瘤裸鼠早期下頜下淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率及微轉(zhuǎn)移率，并與傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemical staining，IHC）及蘇木精-伊紅（hematineeosin，HE）染色方法相比較，為舌鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷與治療提供新的探索性的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。20只BALB/C-nu/nu 裸鼠購買于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，在廣東醫(yī)學(xué)院無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級動物實(shí)驗(yàn)室的超凈層流架中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（20～26 ℃）、恒濕（45%～50%）的潔凈環(huán)境。20只裸鼠（2只因麻醉意外死亡）雌雄兼用，4～6周齡，質(zhì)量為 20～24 g，自由攝入滅菌處理的水和飼料。實(shí)驗(yàn)在SPF條件下的超凈工作臺中進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）（廣譜）單克隆抗體AE1/AE3、PV-9000二步法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；QDs超敏熒光試劑盒（武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司）：包括Tween 20、2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、生物素化馬抗鼠IgG、量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素QDs-SA復(fù)合物、0.1%Triton、緩沖甘油封固劑；RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶，胎牛血清（Gibco公司，美國）；BX51型正置熒光顯微鏡、OLYMPUS顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人舌癌荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的建立與標(biāo)本制作 1）建立裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。裸鼠麻醉后，將傳代培養(yǎng)的人舌癌Tca8113 細(xì)胞注射接種于裸鼠的舌體組織（不過中線），注射細(xì)胞懸液 0.1 mL，細(xì)胞密度為2×106·mL-1。隔日觀察動物1次。注射接種瘤細(xì)胞后10～14 d，切除舌部移植瘤原發(fā)灶，行HE染色，以證實(shí)為裸鼠荷瘤組織。對切除腫瘤后的20只裸鼠創(chuàng)口用無創(chuàng)縫線縫合，術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察動物（其中2只因麻醉意外死亡）。注入腫瘤細(xì)胞 6～7周后，處死動物，并解剖下頜下淋巴結(jié)。2）制作淋巴結(jié)標(biāo)本。將解剖的淋巴結(jié)按照同一只裸鼠、同一組淋巴結(jié)、同一粒淋巴結(jié)分別編號，將同一淋巴結(jié)分為兩份。一份用10%甲醛溶液固定，制作半連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE和IHC染色，用PBS代替一抗作為陰性對照；另一份即刻液氮冷凍，制作冰凍切片，切片厚度約4 μm，采用QDs標(biāo)記的特異性CK抗體免疫熒光檢測，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 HE和IHC染色 取石蠟包埋組織切片一份進(jìn)行常規(guī)HE染色，統(tǒng)計淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移率和微轉(zhuǎn)移率；取另一份進(jìn)行常規(guī)IHC的CK（AE1/AE3）DAB染色，統(tǒng)計淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移率和微轉(zhuǎn)移率。

1.2.3 QDs605-CK（AE1/AE3）免疫熒光染色 取淋巴結(jié)冰凍切片，經(jīng)純冰丙酮固定10 min，蒸餾水沖洗，TBS（pH值為7.2～7.6）洗2次，每次5 min，吸干，滴加0.1%Triton于37 ℃濕盒內(nèi)孵育10 min進(jìn)行通透，TBS洗3次，每次5 min，吸干，滴加2%BSA，37 ℃濕盒內(nèi)封閉30 min，滴加稀釋度為1∶50的一抗CK（AE1/AE3），37 ℃濕盒孵育1 h，TBST（TBS+0.05%Tween 20）洗3次，每次5 min，吸干，滴2%BSA，37 ℃濕盒封閉10 min，滴加二抗（生物素化馬抗鼠IgG，稀釋度為1∶400），37 ℃濕盒中孵育30 min，TBST洗3次，每次5 min，吸干，滴加2%BSA，37 ℃下封閉20 min，再滴加QDs-SA復(fù)合物（605 nm），37 ℃濕盒孵育30 min，TBST洗3次，每次5 min，TBS洗3次，每次5 min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍照，統(tǒng)計裸鼠舌癌淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移率及微轉(zhuǎn)移率。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用χ2檢驗(yàn)，可靠性檢驗(yàn)采用Kappa指數(shù)一致性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人舌癌荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的建立

接種Tca8113細(xì)胞6～10 d后，所有裸鼠舌體組織可見移植瘤生長。10～15 d，舌部移植瘤體積增大至2 mm×3 mm（圖1左），捫之質(zhì)地較硬，剖開呈灰白色（圖1右）。切除的腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示：光鏡下可見大量腫瘤組織，腫瘤細(xì)胞排列緊密，間質(zhì)較少；瘤細(xì)胞核大深染，圓形，核漿比例大，異形性明顯，并可見病理性核分裂，核仁多個，可見瘤巨細(xì)胞；證明裸鼠舌體移植Tca8113腫瘤成功。

圖1 人舌癌荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型Fig 1 Submandibular lymph node metastasis model from nude mouse transplanted human tongue squamous cell carcinoma

20只裸鼠除2只在手術(shù)切除原發(fā)灶時因麻醉死亡外，余18只裸鼠術(shù)后存活，能正常進(jìn)食、進(jìn)水。接種6周后處死動物，部分動物的下頜下淋巴結(jié)可捫及腫大，質(zhì)地中等偏硬；部分裸鼠有輕度消瘦并見舌部移植瘤部位有腫瘤復(fù)發(fā)征象。解剖下頜下淋巴結(jié)，可見轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)質(zhì)地中等偏硬，呈灰白色，直徑3～5 mm（圖1右）；有的轉(zhuǎn)移灶中央壞死。裸鼠舌體復(fù)發(fā)的移植瘤盡管向后部舌根部蔓延，但未見到腫瘤侵犯口底，與轉(zhuǎn)移的下頜下淋巴結(jié)之間有正常的組織間隔開來。這說明本研究成功建立了荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的動物模型。

2.2 淋巴結(jié)組織染色

2.2.1 HE染色 光鏡下可見轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞位于淋巴結(jié)的被膜下竇或髓竇，轉(zhuǎn)移灶呈巢狀，有的可見角化珠或數(shù)個散在的癌細(xì)胞；轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞核大而深染，圓形，核漿比例大，異形性明顯（圖2）。HE染色結(jié)果顯示，18只裸鼠（36個淋巴結(jié)）中有5只出現(xiàn)單側(cè)下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達(dá)27.8%。

圖2 轉(zhuǎn)移的下頜下淋巴結(jié)組織 HE × 100Fig 2 Metastasized submandibular lymph node tissue HE × 100

2.2.2 IHC染色 轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中CK（AE1/AE3）表達(dá)呈陽性，棕褐色的陽性顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)（圖3A）。下頜下淋巴結(jié)HE鏡檢陽性的5只裸鼠對側(cè)淋巴結(jié)CK染色全部為陽性，31個HE鏡檢無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)切片中有11個淋巴結(jié)（6只裸鼠）出現(xiàn)CK染色陽性（圖3B、C）。綜合計算，共有11只裸鼠出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中，5只裸鼠出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，6只出現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率達(dá)61.1%，微轉(zhuǎn)移率為33.3%。

2.2.3 QDs605-CK（AE1/AE3）免疫熒光染色 QDs標(biāo)記的熒光探針與CK結(jié)合定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，發(fā)出紅色熒光，自身正常組織發(fā)出綠色熒光，與IHC染色定位相同（圖4A）。下頜下淋巴結(jié)HE鏡檢陽性的裸鼠QDs免疫熒光染色陽性，其對側(cè)淋巴結(jié)QDs免疫熒光染色也為陽性。31個HE鏡檢無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)冰凍切片經(jīng)QDs免疫熒光染色檢測，有12個淋巴結(jié)7只裸鼠的染色陽性，定位為微轉(zhuǎn)移（圖4B、C、D）。綜合計算，共有12只裸鼠出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中，5只裸鼠出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，7只出現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率達(dá)66.7%，微轉(zhuǎn)移率為38.9%。

2.3 3種染色方法檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的比較

采用QDs605-CK（AE1/AE3）免疫熒光染色法、半連續(xù)切片CK（AE1/AE3）IHC染色法和HE染色法檢測18只裸鼠36個下頜下淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移陽性率分別為66.7%（12/18）、61.1%（11/18）和27.8%（5/18），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，3種方法的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.379，P<0.05）。QDs標(biāo)記的免疫熒光染色法和IHC染色法都優(yōu)于HE染色，但是QDs標(biāo)記的免疫熒光檢測法和IHC檢測法之間的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.120，P>0.05）。

圖3 轉(zhuǎn)移的下頜下淋巴結(jié)組織 IHC × 100Fig 3 Metastasized submandibular lymph node tissue IHC × 100

圖4 轉(zhuǎn)移的下頜下淋巴結(jié)組織 免疫熒光染色 × 400Fig 4 Metastasized submandibular lymph node tissue immunofluorescence staining × 400

3 討論

舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其病理類型98%以上為鱗狀細(xì)胞癌。早期頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響舌癌患者預(yù)后的主要因素之一。即使臨床檢查沒有觸及頸部淋巴結(jié)腫大的患者，頸清掃術(shù)后病理檢查常常發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移，即微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移灶是指常規(guī)病理檢查漏診的微小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶，一般為幾個惡性細(xì)胞或直徑小于2 mm的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶[3]。在淋巴結(jié)臨床分期N0的患者中，頸部淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移率可高達(dá)27.8%～45.0%[4-6]。癌細(xì)胞在頸淋巴系統(tǒng)中的微轉(zhuǎn)移或跳躍性轉(zhuǎn)移是術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因。在目前外科治療舌癌時，為了提高術(shù)后生存率，常對淋巴結(jié)臨床分期N0的患者行常規(guī)選擇性頸淋巴結(jié)清掃術(shù)，使不少淋巴結(jié)實(shí)際并未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者經(jīng)受了過度治療，這無疑違背了功能性外科原則，同時對一部分患者可能帶來不必要的創(chuàng)傷和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。如果能在手術(shù)前或手術(shù)中用微創(chuàng)方法將前哨淋巴結(jié)送快速病理檢查，根據(jù)其性質(zhì)選擇舌癌手術(shù)方式，對提高患者的生存及生活質(zhì)量將具有重要的意義。

在探索檢測舌癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法中，需要建立合適的舌癌轉(zhuǎn)移動物模型。目前通過裸鼠舌體接種Tca8113細(xì)胞的方法建立人舌鱗狀細(xì)胞癌早期下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是較為成熟的模型[7]。免疫熒光技術(shù)是研究動物模型的常用技術(shù)之一。傳統(tǒng)的免疫熒光激發(fā)光譜較窄，發(fā)射光譜較寬，不能同時檢測多種蛋白及標(biāo)記物，同時易耐光漂白，熒光壽命短，很難動態(tài)長時間地觀察追蹤待檢測生物分子。近年來，QDs發(fā)展起來的生物親和性功能化的納米熒光探針完全彌補(bǔ)了這些不足。作為一種理想的功能探針，QDs熒光探針已在細(xì)胞標(biāo)記成像、活體動物成像、腫瘤的前哨淋巴結(jié)成像及組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)檢測方面都取得了重要進(jìn)展[8-9]。臨床上對于腫瘤標(biāo)記物的檢測，IHC技術(shù)可以說是檢測這些指標(biāo)的金標(biāo)準(zhǔn)，而QDs與傳統(tǒng)IHC方法相結(jié)合可提高檢測的靈敏度，尤其對于一些低表達(dá)的生物標(biāo)志物更占優(yōu)勢。Chen等[10]曾在乳腺癌的研究中采用QDs免疫熒光技術(shù)標(biāo)記人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2），并進(jìn)行了量化檢測，結(jié)果表明：QDs標(biāo)記的HER-2表達(dá)優(yōu)于傳統(tǒng)的IHC方法檢測，其檢測方法更為敏感和穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)利用QDs的光學(xué)優(yōu)點(diǎn)，將其作為熒光探針與CK相結(jié)合檢測人舌鱗狀細(xì)胞癌荷瘤裸鼠下頜下淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示：QDs與CK結(jié)合定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，與IHC染色定位相同，發(fā)出紅色熒光，而腫瘤周圍的正常組織發(fā)出綠色熒光，二者形成鮮明對比。18只裸鼠有5只出現(xiàn)下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，7只出現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，其陽性轉(zhuǎn)移率66.7%，微轉(zhuǎn)移率為38.9%。統(tǒng)計結(jié)果顯示，用QDs檢測荷瘤裸鼠人舌鱗狀細(xì)胞癌下頜下淋巴結(jié)，其陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)的HE染色檢測，能夠?qū)α馨徒Y(jié)微轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行檢測；而與IHC檢測方法相比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這與其他文獻(xiàn)[11]報道的結(jié)果相似。在本實(shí)驗(yàn)中，盡管QDs檢測方法與IHC法在檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及微轉(zhuǎn)移率方面無明顯差異，但QDs檢測時CK定位準(zhǔn)確，背景非常干凈，分辨率高，即使單個的轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞也能被敏銳地檢測到。有研究[12]表明，當(dāng)組織本身受激發(fā)光激發(fā)時，組織的自發(fā)熒光會發(fā)生改變，而腫瘤組織中QDs標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的熒光并沒有明顯變化，這種屬性使QDs標(biāo)記法更容易識別腫瘤組織中微小的癌細(xì)胞，而在這點(diǎn)上傳統(tǒng)IHC檢測就明顯不夠清晰與精確。由此可見，對于常規(guī)視野下不能檢測到的微轉(zhuǎn)移灶及細(xì)胞，可同時用IHC法進(jìn)行檢測，但如果檢測結(jié)果不夠清晰，或者檢測結(jié)果不確定，可以嘗試用QDs免疫熒光技術(shù)進(jìn)行檢測。此外，由于QDs的尺寸可以調(diào)節(jié)，光穩(wěn)定性好，熒光壽命長且耐光漂白，故可以通過改變其尺寸或內(nèi)核的組分調(diào)節(jié)QDs的發(fā)射光譜，在熒光顯微鏡下可以發(fā)出不同顏色的光，便于在同一組織中觀察不同標(biāo)志物的同時表達(dá)情況[10]。就這方面而言，QDs熒光探針明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的IHC技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，QDs能夠用于裸鼠舌癌下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移的檢測；但是本實(shí)驗(yàn)還存在很多不足，如樣本量少，未能對活體的動物模型實(shí)施熒光成像動態(tài)觀察等。在以后的實(shí)驗(yàn)中，筆者會和多醫(yī)療單位協(xié)作研究，對舌癌前哨淋巴結(jié)進(jìn)行活體成像，或者對檢測標(biāo)記物進(jìn)行定量分析，這將是進(jìn)一步的研究方向。

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