保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖影響因素研究

劉芳，黃丹，陳永貴，樊江

（四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000）

0 引 言

乳酸菌胞外多糖（EPS）是乳酸菌在其生長代謝過程中分泌到細胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，因其重要的理論和實踐意義，在醫(yī)療、食品、化妝品和酶技術(shù)等方面具有潛在的開發(fā)價值。現(xiàn)有研究表明，可生物合成胞外多糖的乳酸菌主要有：德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、米酒乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液鏈球菌嗜熱亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌等[1]。但不同乳酸菌胞外多糖的合成能力差別很大，不同的營養(yǎng)基質(zhì)和發(fā)酵條件其生物合成量也很不相同。本研究對保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的影響因素進行研究，旨在為高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

牛肉膏，蛋白胨，胰蛋白胨，酪蛋白胨，植物蛋白胨，酵母膏，D-半乳糖，麥芽糖，乳糖為生化試劑；葡萄糖、吐溫80、乙酸鈉、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯甲烷、正丁醇、乙醇（體積分數(shù)95%）、丙酮、苯酚、濃硫酸、蔗糖等為分析純。

1.1.2 儀器設備

校CP114電子天平，YX-18HM手提式壓力蒸汽滅菌器，BH200生物顯微鏡，GZ-250-HSI恒溫培養(yǎng)箱，BCD-216TAM冰箱，TDL-5-A臺式離心機，UV2400/PC紫外可見分光光度計，DHG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱，試管、錐形瓶、移液管等均為學院微生物實驗室常規(guī)儀器。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基[2]：用于菌種的活化、培養(yǎng)、保存和發(fā)酵。

1.1.4 試驗菌種

保加利亞乳桿菌G6（本課題組從市售酸乳中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株，其胞外多糖產(chǎn)量為311.7 mg/L）。

1.2 方法

1.2.1 菌液吸光度的測定及活菌計數(shù)

將活化的保加利亞乳桿菌G6接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h后，取1 mL原液用無菌生理鹽水逐級稀釋，獲不同濃度的稀釋液，各稀釋液于600 nm波長下測其吸光值，取適宜濃度的稀釋液涂布MRS培養(yǎng)基平板，每個稀釋度平行3次，37℃培養(yǎng)48 h后計菌落數(shù)，繪制吸光度與活菌數(shù)的關系圖，通過吸光度的測定，在標準曲線上查找對應的活菌數(shù)，以此獲得濃度為108mL-1菌懸液。

1.2.2 保加利亞乳桿菌G6胞外多糖質(zhì)量濃度的測定

（1）生長曲線的繪制。乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種分泌于細胞外的次生代謝產(chǎn)物，是在對數(shù)期后期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的。本試驗胞外多糖的測定時間為菌株達到穩(wěn)定期的時間。將保加利亞乳桿菌G6按3%的接種量（濃度為108mL-1）接種于裝有30 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)，每2 h于600 nm波長下測其吸光值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光值為縱坐標作出保加利亞乳桿菌G6的生長曲線。

（2）胞外多糖的提取。取10 mL于37℃下培養(yǎng)至穩(wěn)定期的發(fā)酵液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，用1 mol/L的NaOH將上清液調(diào)至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液(濃度為3 g/L，現(xiàn)配現(xiàn)用)，40℃水浴酶解2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿：正丁醇(體積比)=3∶1），振搖30 min后，4 000 r/min離心15 min，去除沉淀，重復1次。加入3～5倍體積的體積分數(shù)為95%乙醇，充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），4 000 r/min離心15 min，得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水兩次，干燥得白色粉末即為多糖（通過此種方法得到的為粗多糖）。

（3）胞外多糖質(zhì)量濃度的測定。采用苯酚-硫酸法測定質(zhì)量濃度，用葡萄糖繪制標準曲線[3]。EPS質(zhì)量濃度的測定：準確吸取10 mL蒸餾水溶解胞外多糖樣品，吸取樣品溶液0.2 mL于試管中，然后按葡萄糖標準曲線制備步驟操作，測定樣品的吸光度，由標準曲線的回歸直線方程求出對應的糖濃度，再乘上樣品稀釋度即得保加利亞乳桿菌G6的胞外多糖濃度。

1.2.3 保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖影響因素的研究

（1）單因素實驗。以MRS液體培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基，改變碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）、磷酸鹽（磷酸氫二鉀），其他配方不變，考察營養(yǎng)基質(zhì)種類和質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響；改變初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間，考察發(fā)酵條件對EPS產(chǎn)量的影響。每組培養(yǎng)基的配方和試驗條件都取前面試驗優(yōu)化后的最佳營養(yǎng)要素和最佳發(fā)酵條件。

（2）正交實驗。 實驗設置4因素3水平，進行L9（34）的正交試驗，4個因素均為單因素實驗中對胞外多糖產(chǎn)量影響較大的因素，3個水平均取單因素實驗的最佳值和左右值。其他實驗條件不變，采用相同的方法測定胞外多糖產(chǎn)量，確定出高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件。

（3）驗證實驗。采用最佳工藝條件進行發(fā)酵，以相同的方法測定胞外多糖產(chǎn)量。平行3次，比較其EPS產(chǎn)量，并求出平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌液吸光度與活菌數(shù)關系

菌液吸光度與活菌數(shù)關系如圖1所示。由圖1可以看出，不同濃度稀釋液的吸光度與活菌數(shù)線性關系良好，通過測定各稀釋液的吸光度，就可在標準曲線上查找對應的活菌數(shù)，以此獲得濃度為108mL-1菌懸液，保證各發(fā)酵試驗的接種量相對一致。

圖1 吸光度與活菌數(shù)關系

2.2 生長曲線

保加利亞乳桿菌G6的生長曲線如圖2所示。由圖2可以看出，保加利亞乳桿菌G6延滯期較短，4 h后進入對數(shù)期，32 h后進入穩(wěn)定期。本研究確定保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵時間為40 h。

圖2 保加利亞乳桿菌G6生長曲線

葡萄糖標準曲線如圖3所示。

2.3 保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖影響因素

2.3.1 不同碳源對EPS產(chǎn)量的影響

碳源種類的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，葡萄糖為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)碳源。葡萄糖質(zhì)量濃度的影響結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出，當葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖3 葡萄糖標準曲線

圖4 碳源對EPS產(chǎn)量的影響

圖5 葡萄糖質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.2 不同氮源對EPS產(chǎn)量的影響

氮源種類的影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，蛋白胨為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)氮源。蛋白胨質(zhì)量濃度的影響如圖7所示，由圖7可以看出，當質(zhì)量濃度為10 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖6 氮源對EPS產(chǎn)量的影響

圖7 蛋白胨質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.3 不同磷酸鹽對EPS產(chǎn)量的影響

磷酸鹽源種類的影響結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，K2HPO4為保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)磷酸鹽源。K2HPO4質(zhì)量濃度的影響結(jié)果如圖9所示，由圖9可以看出，當K2HPO4質(zhì)量濃度為3.0 g/L時EPS產(chǎn)量最高。

圖8 磷酸鹽對EPS產(chǎn)量的影響

圖9 K2HPO4質(zhì)量濃度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.5 不同初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

初始pH的影響結(jié)果如圖10所示。由圖10可以看出，當pH值為4.5～6.0時，胞外多糖產(chǎn)量隨pH值的升高而增大，當pH值為6.0～7.0時，胞外多糖產(chǎn)量隨pH值的增大而減小，pH值為6.0時胞外多糖產(chǎn)量達到最高值。這是因為低或高的pH值，既不利于乳酸菌生長，亦不利于胞外多糖產(chǎn)量的積累。故本試驗的初始pH值初步確定為6.0。

2.3.6 溫度對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度的影響結(jié)果如圖11所示。由圖11可以看出，當溫度小于36℃時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量隨溫度的升高而增大，當溫度高于36℃時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量隨溫度的升高而減小。這是因為菌體在相對較低的溫度下，細胞的生長和細胞壁的合成較慢，有利于胞外多糖的合成。故本試驗的發(fā)酵溫度初步確定為36℃。

圖10 初始pH值對EPS產(chǎn)量的影響

圖11 發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.7 不同發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間的影響結(jié)果如圖12所示。由圖12可以看出，38 h以前隨發(fā)酵時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量增大，38 h以后隨發(fā)酵時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量隨時間的延長而減小。可能是胞外多糖在菌株生長過程中會逐漸被分解成單糖補充碳源使菌株繼續(xù)生長[4]。故本研究的發(fā)酵時間初步確定為38 h。

圖12 發(fā)酵時間對EPS產(chǎn)量的影響

2.3.8 正交實驗

由于氮源、磷酸鹽質(zhì)量濃度對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的影響較小，故僅對葡萄糖質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時間進行L9（34）的正交實驗，結(jié)果如表1所示。以胞外多糖產(chǎn)量作為考察指標，確定出保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件。

由表1可以看出，四因素對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)胞外多糖的影響大小為：葡萄糖質(zhì)量濃度＞初始pH值＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。從K值可知，保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的最佳工藝條件為A3B1C1D1，即葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，發(fā)酵溫度為34℃，初始pH值為5.5，發(fā)酵時間為36 h。

表1 正交實驗結(jié)果

2.3.9 最佳工藝條件的驗證實驗

采用最佳工藝條件進行發(fā)酵，即配制葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，磷酸氫二鉀3.0 g/L，pH值為5.5的MRS液體培養(yǎng)基，于34℃靜置培養(yǎng)36 h。平行3次，結(jié)果如表2所示。

表2 驗證試驗結(jié)果

由表2可以看出，保加利亞乳桿菌G6胞外多糖產(chǎn)量為425.7 mg/L，比優(yōu)化前提高了36.57%。3次測定結(jié)果表明，此最佳工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

（1）對保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的影響因素進行了研究，在MRS液體培養(yǎng)基中，當葡萄糖、蛋白胨和磷酸氫二鉀的質(zhì)量濃度分別為30，10，3.0 g/L，而初始pH值為5.5，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間36 h時，該菌株胞外多糖合成量為425.7 mg/L，比優(yōu)化前提高了36.57%。3次驗證試驗說明此工藝條件具有合理性和穩(wěn)定性。

（2）實驗證明，營養(yǎng)基質(zhì)碳源、氮源和磷酸鹽的種類和質(zhì)量濃度對保加利亞乳桿菌G6產(chǎn)EPS都有不同程度的影響。不同的發(fā)酵條件，得到不同的胞外多糖產(chǎn)量。保加利亞乳桿菌G6高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵溫度較低，菌體在進入穩(wěn)定期后多糖產(chǎn)量最高，培養(yǎng)基在酸性環(huán)境下，EPS生物合成量較大。

（3）本研究可為高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

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