膠體金法定性檢測(cè)牛奶中林可霉素的應(yīng)用

李利芬，楊國輝，趙文君，劉玉茹，張淑麗，姚升峰

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)科爾沁有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古通遼028000）

0 引言

林可霉素類藥物是由鏈霉菌產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素。它是一種強(qiáng)效、窄譜的抑菌性抗生素。林可霉素殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國都對(duì)其作出限量要求，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)-2002動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量100 ng/mL。林可霉素殘留量的常規(guī)檢測(cè)方法主要有高效液相色譜技術(shù)[1]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）[3]、氮磷氣相色譜檢測(cè)法[4]、薄層色譜[5]、氣相色譜[6]等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對(duì)檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查。本文的目的就是介紹快速靈敏地檢測(cè)牛奶中林可霉素殘留的方法--膠體金免疫層析法，測(cè)該方法為定性檢測(cè)，并可用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)：方法一林可霉素檢出限40 ng/mL，方法二林可霉素檢出限100 ng/mL。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和設(shè)備

鮮奶樣，12%復(fù)原乳，生乳脂肪層的奶樣。

試劑：雙氧水，碳酸氫鈉，青霉素，糊精，三聚氰胺，氯化銨，北京勤邦林可霉素快速檢測(cè)試紙條。

儀器為德國普蘭德（BRAND）公司制造的移液器。

2 方法

2.1 干擾物質(zhì)的配制備

分別取不含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)與含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的生乳做本底，分別制備出質(zhì)量濃度為20 mg/L雙氧水摻假樣品、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%碳酸氫鈉摻假樣品、100 μg/kg青霉素抗生素?fù)郊贅悠贰?.2%糊精摻假樣品、0.1%三聚氰胺摻假樣品、0.1%銨鹽摻假樣品。

2.2 具體檢測(cè)步驟

（1）使用前將本膠體金免疫層析試紙條和待檢牛奶樣本回復(fù)至室溫。

（2）從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記，在60 min內(nèi)盡快使用。檢測(cè)試劑取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋，防止受潮。

（3）方法一：用微量移液器吸取200 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；方法二：用微量移液器吸取150 μL樣本稀釋液和50 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。

（4）將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中——印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。

（5）室溫（20～25 ℃）孵育5 min 后，取出試紙條判定結(jié)果，其他時(shí)間判定無效。

2.3 結(jié)果判定

（1）陰性（-）：C線顯色，T線顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣品中林可霉素濃度低于檢測(cè)限。

（2）陽性（+）：C線顯色，T線不顯色，表示牛奶樣品中林可霉素濃度高于檢測(cè)限。

（3）無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢出限實(shí)驗(yàn)

對(duì)生乳樣品本底、檢出限點(diǎn)及檢出限附近點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行平行樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 林可霉素快速檢測(cè)試紙條檢出限實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果 ng/mL

3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

使用方法一、方法二對(duì)原奶樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)點(diǎn)質(zhì)量濃度為生乳（空白實(shí)驗(yàn)）、50 ng/mL，100 ng/mL每個(gè)點(diǎn)做10平行，符合率為100%。

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)

3.3.1 陰性干擾

取不含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的生乳做本底，加入如下干擾物質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)情況如表2所示。

表2 林可霉素快速檢測(cè)試紙條陰性抗干擾性能對(duì)比結(jié)果

3.3.2 陽性干擾

取含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的樣品（生乳）做本底，方法一加標(biāo)質(zhì)量濃度為50 ng/mL，方法二加標(biāo)質(zhì)量濃度為100 ng/mL，在制備的陽性樣本中加入如下干擾物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

3.4 批量檢驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)15日使用林可霉素試紙條對(duì)生乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，每天檢測(cè)20個(gè)生乳樣品，檢測(cè)過程中所用林可霉素試紙條未出現(xiàn)失效、不走線等不良情況。

4 結(jié) 論

由上述可以看出，林可霉素定性檢測(cè)膠體金免疫層析法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

表3 林可霉素快速檢測(cè)試紙條陽性抗干擾性能對(duì)比結(jié)果

（1）在檢測(cè)過程中無需前處理，直接檢測(cè)，操作簡便；

（2）整個(gè)檢測(cè)過程用時(shí)6～7min，用時(shí)短；

（3）對(duì)陰性生乳、陽性加標(biāo)樣品分別做了10次重復(fù)性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果相同，重復(fù)性好；

（4）分別對(duì)陰性生乳、陽性加標(biāo)樣品做了8類物質(zhì)的抗干擾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果一致，抗干擾能力強(qiáng)。

綜上所述，采用膠體金免疫層析方法，在NC膜上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣品中的林可霉素和NC膜上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗林可霉素抗體，抑制抗原和抗林可霉素抗體的結(jié)合，對(duì)牛奶樣品中林可霉素做快速定性篩選。運(yùn)用此方法對(duì)生乳中林可霉素殘留量進(jìn)行篩選，與高效液相色譜技術(shù)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS/MS）、氮磷氣相色譜檢測(cè)法、薄層色譜、氣相色譜的檢測(cè)技術(shù)相比上述方法由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對(duì)檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控大量樣本的篩查，而此法樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少，檢測(cè)成本低，可作為林可霉素藥物殘留快速篩選的首選方法。對(duì)于乳品企業(yè)，此法能夠保障到廠原奶及時(shí)出具檢測(cè)結(jié)果，且能夠滿足對(duì)到廠生乳及定容奶倉的定性篩選排查，可將儀器法作為此法的確認(rèn)法。

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