影響植物乳桿菌T102生長與產細菌素能力的因素

徐瑩，梁紅敏

（包頭輕工職業技術學院乳品工程學院，內蒙古，包頭014035）

0 引言

細菌素是由一類具有抑菌活性的蛋白質或多肽，其抑菌范圍不僅僅局限于親緣關系較近的種，而且，產生細菌素菌株對該細菌素具有自身免疫性[1-2]，能夠抑制腐敗菌和致病菌的生長。如今，國內外已分離鑒定到多種產細菌素的乳酸菌菌株，有些乳酸菌素作為食品防腐劑被廣泛用于工業生產[3]。細菌素的產生一般與菌株的生長情況有關[4-6]。同時,細菌素的產量還受菌株的培養條件和培養基成分等多種因素影響。

植物乳桿菌T102是從中國自然發酵香腸中分離篩選到具有較強產細菌素能力的乳酸菌菌株，對影響植物乳桿菌T102菌株生長與產細菌素的因素進行研究，對進一步開發利用該菌株細菌素具有重要意義。

1 實驗

1.1 材料與設備

菌株為植物乳桿菌T102（實驗室從自然發酵香腸中分離鑒定所得）；指示菌為金黃色葡萄球菌（來自實驗室保存）。

培養基為MRS培養基和LB培養基[7]。

設備：SPX-250B-Z生化培養箱，HS-840u超凈工作臺，Acculab電子分析天平，722s紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性實驗

采用改良的瓊脂擴散法[8]測定抑菌活性，以金黃色葡萄球菌為指示菌。發酵液以8 000 g離心20 min得到發酵上清液，調節pH值為7.0，上清液中加入質量濃度為600 g/L硫酸銨飽和溶液在4℃下震蕩過夜，已脫鹽的溶液過0.22 μm濾膜得到細菌素溶液。粗提的細菌素連續稀釋備用。制備質量濃度為8 g/L瓊脂的LB培養基，滅菌后冷卻至50℃，接入金黃色葡萄球菌（106mL-1），混勻后傾倒平板，取50 μL上述細菌素溶液于平板上，在37℃下培養48 h。細菌素效價采用標準曲線法測定[9]。

1.2.2 植物乳桿菌T102生長量及活菌數

測定方法：用722s分光光度計在600 nm處，測接種的MRS液體培養基的吸光值（OD值），活菌數采用平板計數法測定。

1.2.3 培養條件對菌株生長及產細菌素能力的影響

（1）培養溫度的影響。培養基pH值不變，分別在20，25，30，37，45 ℃5個溫度下培養24 h，測OD值及細菌素效價。

（2）培養基初始pH值的影響。用濃度為6 mol/L的HCl或NaOH調pH值為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，121℃滅菌15 min，30℃下培養24 h，測OD值及細菌素效價。

1.2.4 培養基營養成分對菌株生長及產細菌素能力的影響

在MRS基礎培養基中，分別替換其中的碳源、氮源，添加不同濃度的KH2PO4、NaCl和吐溫-80，在培養基初始pH值為6.0，30℃下培養24 h，測定OD值、細菌素效價及植物乳桿菌T102的活菌數。以MRS基礎培養基為正常對照組。

2 結果與分析

2.1 培養條件對菌株生長及產細菌素能力的影響

2.1.1 溫度的影響

培養基pH值不變，分別在不同溫度下培養24 h，測定OD值及細菌素效價。結果如圖1所示。

圖1 培養溫度對菌株生長及產細菌素能力的影響

由圖1可以看出，培養基pH值一定的條件下，不同溫度培養時，植物乳桿菌T102菌株的生長和產細菌素的能力有很大的不同。在37℃時，菌株達到最大生物量時，所產細菌素的生物活性卻沒有在30℃時的高。這說明菌株最適生長溫度并不是細菌素活性最大時的溫度，這與一些資料報道的某些細菌素在低于最適生長溫度下反而細菌素產量較高相符合，說明細菌素的產生或許是一種應激機制，對不適應于其最佳生長環境的一種應激反應[10-11]。菌株T102在30℃培養24 h細菌素效價最高可達590 IU/mL，在20℃時沒有檢測到細菌素的產生，而且菌株在該溫度下生長速度緩慢。

2.1.2 培養基初始pH值的影響

將MRS培養基初始pH值分別調至4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，8.0和9.0，30 ℃下培養24 h后，測定菌體生長量及細菌素效價，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，培養基初始pH值對細菌素的產生有明顯的影響。初始pH值為6.0時，培養24 h后菌株產細菌素達到最高產量，為589 IU/mL,初始pH值為7.0，在培養24 h后，菌株的生物量達到最高，但細菌素效價低于初始pH值為6.0的效價，初始pH值為5.0和8.0的菌株生長緩慢，且只有少量的細菌素檢出，初始pH值為4.0和9.0的無抑菌活性檢出。這說明菌株細胞的生長與細菌素的產生并不是完全成比例，細菌素在一定的pH值條件下才會合成，偏酸或偏堿都不利于細菌素的產生，這可能與細菌素的合成機制有關。

圖2 初始pH值對菌株生長及產細菌素能力的影響

2.2 培養基營養成分的影響

2.2.1 碳源的影響

在培養基中加入質量分數2%的不同碳源，30℃培養24 h后,分別測定活菌數、菌體生長量及細菌素效價。結果如表1所示。

表1 碳源對菌株生長及產細菌素能力的影響

由表1可以看出，不同碳源對菌株生長和細菌素的產生具有較大的影響。添加果糖、乳糖、麥芽糖的培養基，植物乳桿菌T-102的活菌數、生長量和效價值都比正常對照值高，其中，乳糖是最易利用的碳源，菌株生長和合成細菌素的能力都最強，該菌株對蔗糖和淀粉的能力較弱，菌株雖然也可以利用蔗糖和淀粉但是生長和合成細菌素能力較低。

在以乳糖為培養基碳源的基礎上,又研究了乳糖濃度對菌體生長及細菌素素合成的影響.在培養基中加入不同質量分數的乳糖,培養24 h后,測定活菌數、菌體生長量及細菌素活性.結果如表2所示。由表2可以看出，2.5%的乳糖對菌體生長和細菌素的合成效果最好。

表2 乳糖濃度對菌株生長及產細菌素能力的影響

2.2.2 氮源的影響

在培養基中加入質量分數為2%的不同氮源,30℃培養24 h后,分別測定活菌數、菌體生長量及細菌素效價。結果如表3所示。

表3 氮源對菌株生長及產細菌素能力的影響

由表3可以看出，與其他氮源相比，牛肉膏和酵母提取物的菌體生長量與合成細菌素的能力都比正常值要高，酵母提取物是最易利用的氮源，活菌數、菌體生長量和成和細菌素的能力都最高，菌株雖然也能利用酪蛋白，但是菌株的活菌數和合成細菌素的能力都明顯較低。氮源的種類影響細菌素的產量，這可能與細菌素合成機制有關，可能某些氮源中豐富的成分誘導了細菌素基因的啟動[12]。

在以酵母提取物為培養基氮源的基礎上,研究酵母提取物濃度對菌體生長及細菌素素合成的影響.在培養基中加入不同濃度的酵母提取物,培養24 h后,測定活菌數、菌體生長量及細菌素活性.結果如表4所示,可以看出，2.0%酵母提取物對菌體生長和細菌素的合成能力最好。

表4 酵母提取物質量分數對菌株生長及產細菌素能力的影響

2.2.3 KH2PO4的影響

在培養基中分別加入質量分數為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的KH2PO4,30℃培養24 h后，分別測定活菌數、菌體生長量及細菌素效價。結果如表5所示。

表5 KH2PO4濃度對菌株生長及產細菌素能力的影響

由表5可以看出，質量分數的不同，菌株的生長和產細菌素能力有所不同，除了2.5%生長量低于正常對照組外，其他濃度的KH2PO4，活菌數、菌體生長量和效價都比正常對照值要高，其中質量分數為2.0%的KH2PO4最有利于菌體生長和合成細菌素，質量分數為2.5%的KH2PO4合成細菌素的能力下降。

2.2.4 NaCl的影響

在培養基中分別加入質量分數為0.5%，1.0%，3.0%，5.0%的NaCl,30℃培養24h后,分別測定活菌數、菌體生長量及細菌素效價。結果如表6所示。

表6 NaCl質量分數對菌株生長及產細菌素能力的影響

由表6可以看出，添加NaCl對菌株生長和細菌素合成能力都有影響。0.5%和1.0%的活菌數、菌體生長量和效價都比正常對照值要高，其中1.0%NaCl最有利于菌體生長和合成細菌素。質量分數為3.0%的NaCl雖然菌株能夠正常生長，但合成細菌素的能力下降，質量分數為5.0%的NaCl活菌數和菌體生長量和效價較正常值低，不利于菌株的生長，產細菌素的能力明顯下降，因此，較高的NaCl濃度阻礙菌株生長和產細菌素。

2.2.5 吐溫-80的影響

在培養基中分別加入質量濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L的吐溫-80,30℃培養18 h后,分別測定活菌數、菌體生長量及細菌素效價。結果如表7所示。

表7 吐溫-80對菌株生長及產細菌素能力的影響

由表7可以看出，不添加吐溫-80，菌體可以正常生長，但是卻沒有產生細菌素。與其他濃度吐溫-80的相比，質量濃度為1.0 g/L的吐溫-80合成細菌素的能力都最高，菌體生長沒有明顯的差異，說明吐溫-80對細菌的生長沒有促進作用，但是對細菌素的產生卻有重大的影響。吐溫-80的濃度越大，菌體生長量與合成細菌素的能力反而降低。吐溫-80是一種乳化劑，它可以降低菌體與培養基接觸面之間的表面張力，從而改善乳酸菌細胞膜的通透性，促進營養物質進入細胞及代謝產物排出體外，因而促進細菌素的產生從而使細菌素的活力增強[13]。

3 結論

在培養基pH值不變的條件下，30℃時的細菌素活性較高，而37℃時菌體的生長量最大，在20℃時沒有檢測到細菌素的產生，而且菌株在該溫度下生長速度緩慢。在培養基初始pH值為6.0時菌體生長量較低，但是細菌素活性要高于pH值為7.0的培養基,初始pH值為4.0和9.0的無抑菌活性檢出。乳糖合成細菌素的能力最強，菌株雖然也可以利用蔗糖和淀粉但是合成細菌素能力較低。酵母提取物是最易利用的氮源，活菌數、菌體生長量最大的同時合成細菌素的能力也最高。分別添加質量分數為2.5%乳糖、2.0%酵母提取物、2.0%的KH2PO4和1.0%的NaCl最有利于菌體生長和合成細菌素。吐溫-80沒有顯著促進菌株生長的作用，但是對細菌素的合成具有很大的影響，質量濃度為1.0 g/L的吐溫-80合成細菌素的能力最高。本研究有助于深入了解培養條件和培養基營養成分對植物乳桿菌T102生長及產細菌素能力的影響，但是還需進一步進行植物乳桿菌T102發酵產細菌素的條件優化，使植物乳桿菌T102細菌素能夠得到廣泛應用。

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