野生酸荔枝核中多糖的提取及其抗氧化活性

錢(qián)力+陳華妮+勞玲玲+陸永旺+伍師書(shū)

摘要：研究了從野生酸荔枝（Litchi chinensis Sonn）核中提取多糖的最佳條件及其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，在此條件下多糖的提取率為5.72%。體外試驗(yàn)表明，酸荔枝核多糖對(duì)·OH具有明顯的清除作用。

關(guān)鍵詞：酸荔枝（Litchi chinensis Sonn）核;多糖;提取;抗氧化

中圖分類號(hào)：R284.2;S58 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4949-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.047

Extracting Polysaccharides from Seeds of Wild Acid Litchi and Its Antioxidant Activity

QIAN Li1，CHEN Hua-ni2， LAO Ling-ling1， LU Yong-wang1， WU Shi-shu1

（1.Baise University， Baise 533000，Guangxi，China ;2. Youjiang Medical College for Nationalities， Baise 533000， Guangxi，China）

Abstract： The optimal conditions of extracting polysaccharides from seeds of wild acid litchi and its antioxidant activity in vitro were investigated. The optimal conditions were extraction temperature of 90 ℃， extracttion time of 180 min and the ethanol concentration of 70% vol. Results showed that the polysaccharides from seeds of wild acid litchi had good scavenging effect and reduction power against ·OH.

Key words： ?acid Litchi seeds; polysaccharide; extraction; antioxidation

荔枝（Litchi chinensis Sonn）核為無(wú)患子科植物的干燥種子，主產(chǎn)于廣東、廣西等地，具有行血散結(jié)、祛寒止痛之功效。研究表明荔枝核具有調(diào)節(jié)血脂、降低血糖、抗氧化能力等藥理作用[1-3]。多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，它廣泛參與了細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象及生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如免疫細(xì)胞間信息的傳遞與感受，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，分裂及再生等活動(dòng)。多糖具有多種生物活性，同維持生物機(jī)能密切相關(guān)。因此多糖的研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到越來(lái)越廣泛的重視[4-9]。廣西野生酸荔枝果實(shí)小、核大、肉薄，生長(zhǎng)處于野生狀態(tài)，管理粗放。對(duì)酸荔枝核中多糖的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)其相關(guān)特性開(kāi)展研究有著重要的意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

原料為廣西靖西深山采摘的野生酸荔枝（采集的樣品經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院張數(shù)球教授鑒定確認(rèn)）。將酸荔枝的核取出，洗凈、干燥、粉碎后備用。主要試劑葡萄糖，鹽酸，無(wú)水乙醇，硫酸，苯酚，過(guò)氧化氫，十二水合硫酸鐵銨，水楊酸，氯仿，正丁醇等為分析純。

儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-3000，上海亞榮生化儀器廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH6，國(guó)華電器有限公司），循環(huán)水式真空泵（SHZ-D，鞏義市予華儀器有限公司），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），分析天平（CPA64，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），磁力攪拌器（S21-1，金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?依次稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50、100、200、300、350 mg，置于500 mL容量瓶中加蒸餾水定容，分別稀釋成10、20、40、60、70 μg /mL的5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液。再分別精確量取1.00 mL樣品液5份，置于25 mL的比色管中。加1.50 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.50 mL濃硫酸，混勻后放置20 min[10，11]。用紫外分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.2.2 ?酸荔枝核多糖的提取與純化 ?稱取酸荔枝核粉10 g，設(shè)置單因素試驗(yàn)，考察提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取率的影響。各因素水平設(shè)置如下：①提取時(shí)間：2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h;②提取溫度：40、50、60、70、80 ℃;③乙醇體積分?jǐn)?shù)：50%、60%、70%、80%、90%。回流結(jié)束后過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，再分別用氯仿，乙酸乙酯萃取后，即得酸荔枝核多糖粗品。以多糖粗品的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出最佳提取條件。

將所得的酸荔枝核多糖粗品放在錐形瓶中，加入適量的活性炭，混勻后，靜置過(guò)夜，得脫色后的酸荔枝核多糖粗品。加入體積為前一步驟所得的多糖水溶液體積1/4的氯仿，再加入體積為氯仿體積1/4的正丁醇，將混合物劇烈震蕩20～30 min，通過(guò)分液漏斗除去水層和溶劑層之間的變性蛋白，如此重復(fù)3次，將蛋白質(zhì)除去，即得到多糖樣品。將得到多糖樣品置于150 mL錐形瓶中，加入1 mol/L的硫酸2.00 mL。充分搖勻后放入沸水浴2 h。冷卻后，再將水解液轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶并加去離子水定容至刻度。分別精確量取樣品液40 μL 5份，分別置于25 mL比色管，以去離子水補(bǔ)充至2.0 mL加1.5 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.5 mL濃硫酸，混均后放置20 min。用紫外分光光度計(jì)于490 nm處，測(cè)其吸光度，由回歸方程計(jì)算酸荔枝核多糖的含量。

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除效果 ?參照Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基，化學(xué)反應(yīng)為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會(huì)減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號(hào)，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號(hào)各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1 h，并與空白液比較，于510 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算其清除率，得到被測(cè)物對(duì)·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說(shuō)明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結(jié)果

2.2.1 ?提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 ?提取時(shí)間對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降。可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致雜質(zhì)過(guò)多。加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能使多糖分解。故最佳提取時(shí)間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對(duì)提取率的影響 ?溫度對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，回流溫度低于70 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時(shí)提取率有所下降。可能是是由于過(guò)高的溫度導(dǎo)致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，可能會(huì)使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，取100 g酸荔枝核過(guò)40目篩的細(xì)粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對(duì)·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到70%。

3 ?結(jié)論

試驗(yàn)以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對(duì)多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗(yàn)表明，酸荔枝核多糖對(duì)·OH具有明顯的清除作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)酸荔枝的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陸永旺，勞玲玲，陳華妮，等.酸荔枝核黃酮體外抗氧化作用的研究[J].中國(guó)釀造，2013，32（7）：104-106.

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[7] 董海麗，劉 ?紅.濕法超微粉碎提取石斛多糖的研究[J].北方園藝，2013，（15）：150-152.

[8] 左紹遠(yuǎn)，錢(qián)金栿.紅花蜂花粉多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性質(zhì)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（7）：1631-1633.

[9] 靳學(xué)遠(yuǎn)，劉 ?紅，秦 ?霞.超聲波輔助提取壺瓶棗多糖工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（14）：3386-3387.

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[11] 崔紅華，李超英，張大方，等.用苯酚-硫酸法測(cè)定人參多糖含量的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，1999，6（2）：24-26.

[12] 袁建梅，呂馨馨，王春峰.合歡花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（11）：2625-2628.

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除效果 ?參照Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基，化學(xué)反應(yīng)為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會(huì)減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號(hào)，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號(hào)各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1 h，并與空白液比較，于510 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算其清除率，得到被測(cè)物對(duì)·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說(shuō)明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結(jié)果

2.2.1 ?提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 ?提取時(shí)間對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降。可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致雜質(zhì)過(guò)多。加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能使多糖分解。故最佳提取時(shí)間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對(duì)提取率的影響 ?溫度對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，回流溫度低于70 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時(shí)提取率有所下降。可能是是由于過(guò)高的溫度導(dǎo)致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，可能會(huì)使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，取100 g酸荔枝核過(guò)40目篩的細(xì)粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對(duì)·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到70%。

3 ?結(jié)論

試驗(yàn)以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對(duì)多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗(yàn)表明，酸荔枝核多糖對(duì)·OH具有明顯的清除作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)酸荔枝的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

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[5] 李艷菊，李琴山，田 ?碩，等.貴州產(chǎn)天冬中多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（7）：1436-1437.

[6] 黃鳳香，廖 ?迎，曾建紅，等.廣西莪術(shù)多糖水提工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地多糖含量測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（16）：3947-3950.

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[8] 左紹遠(yuǎn)，錢(qián)金栿.紅花蜂花粉多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性質(zhì)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（7）：1631-1633.

[9] 靳學(xué)遠(yuǎn)，劉 ?紅，秦 ?霞.超聲波輔助提取壺瓶棗多糖工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（14）：3386-3387.

[10] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社， 1999.

[11] 崔紅華，李超英，張大方，等.用苯酚-硫酸法測(cè)定人參多糖含量的研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，1999，6（2）：24-26.

[12] 袁建梅，呂馨馨，王春峰.合歡花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（11）：2625-2628.

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除效果 ?參照Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生自由基，化學(xué)反應(yīng)為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長(zhǎng)有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會(huì)減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號(hào)，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號(hào)各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動(dòng)反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1 h，并與空白液比較，于510 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算其清除率，得到被測(cè)物對(duì)·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說(shuō)明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結(jié)果

2.2.1 ?提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 ?提取時(shí)間對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降。可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致雜質(zhì)過(guò)多。加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能使多糖分解。故最佳提取時(shí)間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對(duì)提取率的影響 ?溫度對(duì)酸荔枝核多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，回流溫度低于70 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時(shí)提取率有所下降。可能是是由于過(guò)高的溫度導(dǎo)致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，可能會(huì)使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，取100 g酸荔枝核過(guò)40目篩的細(xì)粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對(duì)·OH的清除結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對(duì)·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到70%。

3 ?結(jié)論

試驗(yàn)以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對(duì)多糖提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間3.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗(yàn)表明，酸荔枝核多糖對(duì)·OH具有明顯的清除作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)酸荔枝的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

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