泛發性肥大細胞增多癥一例及KIT基因突變研究

杜斌 汪慧君 林志淼

泛發性肥大細胞增多癥一例及KIT基因突變研究

杜斌 汪慧君 林志淼

目的檢測1例泛發性肥大細胞增多癥患者KIT基因突變情況，為患者提供預后判斷及治療選擇。方法收集患者臨床資料，提取患者，其父母以及200例健康人外周血DNA，采用PCR擴增KIT基因編碼區的全部外顯子及其側翼序列并測序。結果基因檢測發現患者外周血DNA中的KIT基因發生c.1526A＞T雜合突變，導致氨基酸出現p.Lys509Ile改變，父母及200例健康對照均未見相同突變。結論KIT基因p.Lys509Ile突變可能為泛發性肥大細胞增多癥患者病因之一。

肥大細胞增生癥，皮膚；KIT；DNA突變分析

肥大細胞增多癥(mastocytosis，OMIM#154800)，是一種肥大細胞異常增殖、聚集的疾病，好發于皮膚、骨髓、肝臟、脾臟、胃腸道及其他內臟系統。根據肥大細胞主要浸潤的靶器官主要分為皮膚型和系統型，其中皮膚肥大細胞增多癥的肥大細胞的浸潤僅局限于皮膚，不累及其他內臟器官或骨髓。皮膚肥大細胞增多癥又可分為3種亞型:肥大細胞瘤、色素性蕁麻疹及泛發性肥大細胞增多癥(generalized mastocytosis，GM)[1]。我們在臨床上收集到1例散發GM患者，并對其進行KIT基因突變進行研究。

一、病歷資料

2歲7個月男性兒童，出生2個月后反復于受熱、摩擦或劇烈運動后在軀干和四肢起水皰，伴有皮膚潮紅和劇烈瘙癢，嚴重時伴精神煩躁，父母訴患者數次發作嚴重時出現低血壓性休克。隨年齡增大，皮膚起皰減少，但逐漸出現全身皮膚增厚，伴頭發脫落。否認嘔吐，腹瀉病史，否認哮喘、過敏性鼻炎病史。父母否認近親結婚，家族中無類似病史。體檢:患者額部右側皮膚可見一黃豆大小厚壁緊張性水皰(圖1a)，全身皮膚增厚，形成棕色皮革樣外觀(圖1b，1c)，皮膚劃痕癥陽性。患兒頭部毛發稀疏、干燥。軀干肥厚皮革樣皮損行組織病理檢查提示:真皮淺中層大量肥大細胞浸潤(圖1d)。骨髓穿刺檢查:正常增生骨髓象，未見異常肥大細胞浸潤。腹部B超提示:肝、腎、胰、脾均未見異常，胸部X線片未見異常。患者血尿糞常規，生化指標均正常。臨床診斷為泛發性肥大細胞增多癥。經口服酮替芬及抗組胺藥物治療1周后，皮膚潮紅、水皰及瘙癢癥狀明顯減輕。

二、方法

1.DNA的提取:抽取患者及其父母外周血2ml，2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，以低滲溶血以及酚-氯仿抽提法提取DNA。同時在數據庫中隨機選擇200例無關健康人基因組DNA作對照。本研究經北京大學第一醫院倫理委員會批準，患兒父母已簽署研究知情同意書。

2.PCR引物設計:根據網站http：//www.ensembl.org/index.html公布的KIT基因序列，利用Primer3在線軟件(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3)設計21對特異性引物擴增患者KIT基因編碼區21個外顯子及其側翼序列，引物由北京天一輝遠生物技術公司合成。其中9號外顯子引物上游引物為5'-AAAAGTATGCCACATCCCAAG-3'，下游為5'-TGACA TGGTCAATGTTGGAA-3'。

3.PCR反應及測序:PCR反應體系25 μl，含基因組DNA 10 ng，dNTP 0.4 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，上下游引物各10 μmol/L，Taq DNA聚合酶 2.5 U。反應條件:95℃預變性5 min后，進行以下10個循環:94℃變性30 s，62℃退火30 s(每個循環以后退火溫度減少0.5℃)，72℃延伸45 s，接著進行30個循環:94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40個循環，最后72℃延伸9 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物。所有PCR產物純化后送至北京天一輝遠生物科技公司測序。

圖1 患兒臨床及組織病理表現 1a:患兒額部右側水皰，毛發稀疏、干燥；1b、1c:右手背及腹部皮膚彌漫性增厚，呈皮革樣外觀；1d:皮損組織病理:真皮淺、中層肥大細胞浸潤，箭頭所示為肥大細胞(HE×400)

三、結果

以患兒的外周血基因組DNA為模板，21對引物在各自的條件下分別擴增出各自產物，包括所有外顯子的編碼序列以及兩端至少60 bp的側翼序列。所有產物純化后測序結果與Ensembl網站所公布的序列進行對照發現，患兒的KIT基因9號外顯子第1 526位核苷酸(從cDNA編碼起始位點ATG算起)發生A→T雜合突變(c.1526A＞T)，導致編碼氨基酸發生p.Lys509Ile改變，患兒父母均不攜帶該突變。所有突變均由反向測序得到驗證(圖2)。200例健康對照者均未見上述突變。

四、討論

皮膚肥大細胞增多癥好發于兒童，預后良好，通常在青春期前自發緩解[2-3]。在皮膚肥大細胞增多癥的3種類型中，色素性蕁麻疹發病率最高，其次是肥大細胞瘤，最少見的是GM[4]。與皮膚肥大細胞增多癥中其他兩種亞型不同的是，GM常伴隨更嚴重的系統癥狀，包括低血壓、休克、嚴重腹瀉及胃腸道反應，特別在嬰兒癥狀往往比較嚴重，可因低血容量性休克導致死亡。然而，這些癥狀一般會隨年齡增長逐漸緩解[5]。水皰是GM最早出現的癥狀之一，通常出現在2歲之前。隨著年齡的增加，通常在3～5歲，表真皮交界處基底膜帶結構更加穩定之后水皰逐漸減少[5-6]。2歲之后DCM患者的皮膚逐漸出現水腫增厚、色素沉著等改變，形成一種特征性的的皮革樣外觀[5]。本文患兒早期病情嚴重，反復出現低血壓休克等癥狀，且皮膚反復出現水皰，隨著年齡增長，皮膚水皰逐漸減輕，符合皮膚肥大細胞增多癥的臨床過程。

引起肥大細胞增多癥的KIT基因突變為功能增強型突變，且絕大多數為體細胞突變，突變后引起肥大細胞的異常克隆性增生。KIT基因種系突變導致肥大細胞增多癥較少見。本研究中DCM患者為KIT基因p.Lys509Ile種系突變，父母均未攜帶該突變，提示是一個新發突變。本例患兒年齡較小，目前骨髓穿刺尚未發現異常肥大細胞浸潤，且未出現其他系統累及的臨床癥狀，該患者的部分臨床表現如水皰、潮紅、低血壓性休克等癥狀隨年齡增大逐漸減輕。目前該患兒每半年進行1次隨訪，病情穩定且緩慢好轉。

圖2 KIT基因測序圖 2a:箭頭所示為c.1526A＞T；2b:健康對照

[1]Arock M，Valent P.Pathogenesis，classification and treatment of mastocytosis：state of the art in 2010 and future perspectives[J].Expert Rev Hematol，2010，3(4)：497-516.

[2]Valent P，Horny HP，Escribano L，et al.Diagnostic criteria and classification of mastocytosis：a consensus proposal[J].Leuk Res，2001，25(7)：603-625.

[3]Caplan RM.The natural course of urticaria pigmentosa：analysis and follow-up of 112 cases[J].Arch Dermatol，1963，87：146-157.

[4]Kiszewski AE，Durán-Mckinster C，Orozco-Covarrubias L，et al.Cutaneous mastocytosis in children：a clinical analysis of 71 cases[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2004，18(3)：285-290.

[5]Briley LD，Phillips CM.Cutaneous mastocytosis：a review focusing on the pediatric population[J].Clin Pediatr(Phila)，2008，47(8)：757-761.

[6]Hannaford R，Rogers M.Presentation of cutaneous mastocytosis in 173 children[J].Australas J Dermatol，2001，42(1)：15-21.

2013-09-16)

(本文編輯:尚淑賢)

Diffuse cutaneous mastocytosis：a case report and mutation analysis of the KIT gene

Du Bin*，Wang Huijun，Lin Zhimiao.*Department of Dermatology，Daqing Oilfield General Hospital，Daqing 163001，Heilongjiang，China

Du Bin，Email：dqxiaobin2000@163.com

ObjectiveTo analyze KIT gene mutations in one patient with diffuse cutaneous mastocytosis(DCM)，and to provide a basis for the prediction of prognosis and selection of treatment.MethodsClinical data were collected from a boy with DCM.Peripheral blood samples were obtained from the patient，his parents and 200 unrelated healthy human controls.PCR was performed to amplify 21 coding exons and their flanking sequences of the KIT gene followed by DNA sequencing.ResultsA heterozygous missense mutation(c.1526A ＞T)，which leads to the mutation p.Lys509Ile，was detected in the KIT gene of the patient，but not in his parents or the healthy controls.ConclusionThe heterozygous missense mutation p.Lys509Ile in the KIT gene may be a cause of DCM.

Mastocytosis，cutaneous；KIT gene；DNA mutational analysis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.020

國家自然科學基金(81201220)

163001黑龍江，大慶油田總醫院皮膚科(杜斌)；北京大學第一醫院皮膚科(汪慧君、林志森)

杜斌，Email:dqxiaobin2000@163.com