苯烯莫德對變應性接觸性皮炎BALB/c小鼠模型的影響

錢佳麗 徐宏俊 趙琰 孫青苗 馬曉蕾 黃海艷 張建中

苯烯莫德對變應性接觸性皮炎BALB/c小鼠模型的影響

錢佳麗 徐宏俊 趙琰 孫青苗 馬曉蕾 黃海艷 張建中

目的探討苯烯莫德對小鼠變應性接觸性皮炎模型的療效。方法用2，4-二硝基氟苯對BALB/c小鼠進行皮膚致敏和激發，分別建立急性和慢性小鼠接觸性皮炎模型。將實驗小鼠分為7組，分別為正常對照組、無水乙醇組、苯烯莫德0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量組、0.1%地塞米松組和0.1%他克莫司組(n=6)。觀察外用苯烯莫德的療效，包括對小鼠耳廓腫脹程度(包括雙耳質量差與厚度差的變化)、病理學改變及皮損組織炎癥細胞計數的影響；用藥結束時評價苯烯莫德的用藥安全性。結果在急性接觸性皮炎模型中，苯烯莫德在24 h內的治療作用不明顯；0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量組雙耳質量差與基質對照組相比，差異均無統計學意義(均P＞0.05)；雙耳厚度差與基質對照組相比，差異亦無統計學意義(P＞0.05)。在慢性接觸性皮炎模型中，苯烯莫德可明顯緩解耳部腫脹程度，0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量組苯烯莫德外用3周后，雙耳質量差[(2.33± 0.45)mg，(2.30± 0.57)mg，(2.38± 0.27)mg]與基質對照組[(3.73± 0.33)mg]相比顯著降低，差異均有統計學意義(均P＜0.01)；雙耳厚度差[(71.50±3.15)×10-3mm，(75.50±3.02)×10-3mm，(69.50±2.59)×10-3mm]與基質對照組[(91.83±2.04)×10-3mm]相比顯著降低，差異均有統計學意義(均P＜0.01)。無論是急性接觸性皮炎模型還是慢性接觸性皮炎模型，3個不同劑量苯烯莫德均能顯著降低耳部皮損組織炎癥細胞浸潤(均P＜0.01)。結論外用苯烯莫德對2，4-DNFB所致的小鼠慢性變應性接觸性皮炎具有抑制作用，對急性模型效果不明顯；未監測到局部藥物不良反應。

苯烯莫德；皮炎，變應性接觸性；模型，動物

苯烯莫德(benvitimod)為一種小分子化合物，化學名為5-(2-苯乙烯基)-2-異丙基-1，3-苯二酚。最早從一種土壤線蟲(Heterorhabditis sp.)的共生細菌Photorhabdus iuminescence的代謝產物中分離出來，現已人工合成[1]。有臨床前研究(資料未發表)發現，外用苯烯莫德對銀屑病有一定的治療作用，而對其他皮膚病有無治療作用尚不清楚。本實驗通過觀察苯烯莫德對2，4-二硝基氟苯 (2，4-dinitrofluorobenzene，2，4-DNFB) 誘導的小鼠變應性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)模型的影響，探討苯烯莫德對變應性接觸性皮炎的可能治療作用及用藥安全性，從而探討苯烯莫德在濕疹皮炎類皮膚病中應用的可能性，并為臨床應用提供實驗依據。

材料與方法

一、實驗動物及材料設備

SPF級BALB/c小鼠84只，雌性，6～8周齡，由北京維通利華有限公司生產(合格證號0236325)。苯烯莫德原料粉末產自天濟藥業(深圳)有限公司，地塞米松產自美國Sigma公司，他克莫司產自美國Sigma公司；2，4-二硝基氟苯(2，4-DNFB)由阿法埃莎(中國)化學有限公司生產，并由東京化成工業株式會社分裝；電子數顯卡尺(精度0.01 mm)由北京北量量具機電有限公司生產。

二、實驗藥物及細胞懸液的制備

1.致敏劑及激發溶液的制備:0.5%DNFB致敏液:250 mg DNFB加入丙酮與橄欖油混合液(4∶1)50 ml；0.2%DNFB激發液:250 mg DNFB加入丙酮與橄欖油混合液(4 ∶1)125 ml。

2.外用藥物的配制:地塞米松以無水乙醇為基質配制成濃度為0.1%的工作液；他克莫司以無水乙醇為基質配制成濃度為0.1%的工作液；苯烯莫德以無水乙醇為基質配制成濃度為0.5%、1.0%、2.0%的工作液。

三、實驗方法

1.實驗動物分組:實驗小鼠隨機分為7組(n=6)。其中第1組小鼠不做任何處理(正常對照組)，第2～7組小鼠分別為0.1%地塞米松治療組、0.1%他克莫司治療組、0.5%苯烯莫德治療組、1.0%苯烯莫德治療組、2.0%苯烯莫德治療組、無水乙醇組。

2.變應性接觸性皮炎模型的建立及給藥方法:參考文獻[2-5]的方法，將BALB/c小鼠于實驗前1天(D0)在背部備皮，范圍3.0 cm×3.0 cm；分別于第1天、第2天(D1、D2)在背部去毛部位均勻涂布0.5%DNFB溶液100 μl致敏；第6天(D6)在小鼠的左側耳腹、耳背皮膚涂0.2%DNFB溶液25 μl激發皮炎。①建立經典(急性)ACD模型[3]:激發后24、36 h各給藥1次，于D8(激發后48 h)處死小鼠，觀察藥物的短期療效；②建立慢性ACD模型[4-5]:于第1次激發后，每隔3天再次激發左側耳部，共激發6次。第7天(D7)開始每日用藥2次，于首次用藥后的第21天(D28)處死小鼠，觀察藥物的長期療效。

四、觀察指標

1.小鼠耳厚度及重量測定:①急性ACD模型:用藥24 h后處死小鼠，用電子數顯卡尺測量小鼠左、右耳固定部位的厚度，計算左、右兩耳厚度差值；用直徑為3.5 mm的皮膚圓形打孔器在小鼠的左、右耳中部相同位置打孔，用電子天平測量左、右耳重量，并計算雙耳質量差值；②慢性ACD模型:分別于每1次激發后48 h用電子數顯卡尺測定小鼠左、右耳固定部位的厚度，計算給藥后第1、9、13、21天時左、右兩耳厚度之差；于最后1次給藥后24 h(D28)處死小鼠，立即用皮膚圓形打孔器分別在每組小鼠左、右耳中部打孔，用電子天平測量左、右耳重量差值。

2.組織病理學及皮損炎癥細胞計數:對左耳皮膚分別進行HE染色，觀察皮損組織病理改變，計算高倍鏡(×400)下皮損炎癥細胞數，每張切片連續選擇10個無重疊高倍鏡視野進行計數，相加得到10個高倍視野的炎癥細胞總數。

五、統計學處理

結 果

一、苯烯莫德對ACD模型的臨床觀察

急性ACD組:藥物治療24 h后，苯烯莫德治療組小鼠左耳的皮膚改變(如紅斑、糜爛、滲出)與無水乙醇對照組相當，效果不及0.1%地塞米松組和0.1%他克莫司組；慢性ACD組:與無水乙醇對照組相比，外用0.5%、1.0%、2.0%苯烯莫德治療3周可以抑制變應性接觸性皮炎小鼠耳部皮膚的紅斑、腫脹及毛細血管擴張充血，與0.1%地塞米松組和0.1%他克莫司組相比，臨床改善情況基本相當。在上述3種藥物治療過程中，均未觀察到皮損加重、皮膚萎縮、色素沉著、水皰、毛囊炎等不良反應。

二、苯烯莫德對小鼠ACD模型雙耳質量差影響

急性ACD組:結果如表1所示，0.5%、1.0%、2.0%苯烯莫德3個不同劑量組，雙耳的質量差與無水乙醇組相比，差異無統計學意義(均P＞0.05)；0.1%地塞米松組與無水乙醇組相比顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)；0.1%他克莫司組與無水乙醇組相比顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。慢性ACD組:結果如表1所示，0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量苯烯莫德外用3周后，雙耳的質量差與無水乙醇組相比顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。而3個不同濃度苯烯莫德組雙耳質量差顯著高于0.1%地塞米松組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，提示療效遜于0.1%地塞米松；但與0.1%他克莫司組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。

三、苯烯莫德對小鼠ACD模型雙耳厚度差影響

表1 不同治療藥物對小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)模型雙耳質量差的影響(mg，±s)

表1 不同治療藥物對小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)模型雙耳質量差的影響(mg，±s)

注:n=6。與無水乙醇組相比，a:P＜0.01，b:P＜0.05

組別 急性ACD模型治療24 h慢性ACD模型治療3周無水乙醇組 2.37±0.15 3.73±0.33 0.1%地塞米松組 1.68±0.09a 1.58±0.17a 0.1%他克莫司組 1.97±0.17b 2.13±0.50a 0.5%苯烯莫德組 2.33±0.18 2.33±0.45a 1.0%苯烯莫德組 2.32±0.20 2.30±0.57a 2.0%苯烯莫德組 2.33±0.20 2.38±0.27a

圖1 不同藥物治療后小鼠雙耳厚度差的變化

結果如圖1所示，0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量組苯烯莫德外用治療小鼠ACD，苯烯莫德的起效速度具有一定的時間依賴性特點。

用藥24 h后:0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量苯烯莫德治療組雙耳厚度差分別為(38.17±1.72)×10-3mm、(40.17 ± 1.47)× 10-3mm、(40.67 ± 1.86)×10-3mm，與無水乙醇組(41.00±2.19)×10-3mm相比，差異無統計學意義(均P＞0.05)；0.1%地塞米松組(30.67±2.80)×10-3mm和0.1%他克莫司組(32.33±1.63)×10-3mm與無水乙醇組相比，差異有統計學意義(均P＜0.01)；用藥9 d后:0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量苯烯莫德治療組雙耳厚度差分別為(45.67±1.86)×10-3mm、(48.00±2.45)×10-3mm、(52.33±3.39)×10-3mm，與無水乙醇組(61.67±1.63)×10-3mm相比，差異有統計學意義(均P＜0.01)。用藥3周結束時:0.5%、1.0%、2.0%3個不同劑量苯烯莫德治療組雙耳厚度差分別為(71.50±3.15)× 10-3mm、(75.50 ± 3.02) × 10-3mm、(69.50 ±2.59)×10-3mm，與無水乙醇組(91.83±2.04)×10-3mm相比顯著降低，差異有統計學意義(均P＜0.01)。

四、小鼠左耳皮膚組織病理學改變

HE染色(圖2)顯示，ACD模型組(DNFB+無水乙醇):表皮可見部分缺失，表皮細胞間、細胞內水腫；真皮明顯水腫，真皮內大量炎癥細胞浸潤；膠原纖維間隙增寬；血管擴張，內皮細胞腫脹。不同濃度苯烯莫德治療組:皮膚全層結構基本完整，表皮可見細胞內和細胞間水腫，與ACD模型組相比明顯減輕，真皮內炎癥細胞浸潤明顯減少，各層損害均較ACD模型組明顯減輕。0.1%地塞米松組、0.1%他克莫司治療組:表皮細胞內和細胞間水腫與ACD模型組相比明顯減輕，真皮內炎癥細胞浸潤數目與苯烯莫德各濃度組相比降低，其他改變與苯烯莫德治療組大致相同。

五、小鼠左耳皮膚組織病理炎癥細胞計數

見表2。藥物治療24 h后，苯烯莫德0.5%、1.0%、2.0%3個不同濃度組小鼠左耳炎癥細胞計數與無水乙醇組相比，差異有統計學意義(均P＜0.01)；藥物治療3周結束時:苯烯莫德0.5%、1.0%、2.0%3個不同濃度組的小鼠左耳炎癥細胞計數與無水乙醇組相比，差異有統計學意義(均P＜0.01)，但與0.1%地塞米松和0.1%他克莫司相比，炎癥細胞浸潤更明顯，差異有統計學意義(均P＜0.01)。

圖2 小鼠左耳皮膚組織病理學改變(HE×100) 2a:基質對照組:表皮部分缺失，表皮細胞間、細胞內水腫；真皮明顯水腫，真皮內大量炎癥細胞浸潤；膠原纖維間隙增寬；血管擴張，內皮細胞腫脹；2b:2.0%苯烯莫德治療組:表皮輕度細胞內和細胞間水腫，真皮輕度水腫伴炎性細胞浸潤，與變應性接觸性皮炎(ACD)模型組相比明顯減輕；2c:0.1%地塞米松治療組:表皮未見明顯增厚，表皮內輕度海綿水腫，與ACD模型組相比明顯減輕，真皮未見水腫，少量炎癥細胞浸潤；2d:0.1%他克莫司治療組:表皮無明顯增厚，表皮內輕度海綿水腫，與ACD模型組相比明顯減輕，真皮未見水腫，有少量炎癥細胞浸潤

表2 不同治療藥物對小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)模型皮損組織病理炎癥細胞計數的影響(±s)

表2 不同治療藥物對小鼠變應性接觸性皮炎(ACD)模型皮損組織病理炎癥細胞計數的影響(±s)

注:n=6。a:10個(×400)視野下的細胞總數；b:與無水乙醇組相比，P＜0.01

組別 急性ACD模型治療24 ha慢性ACD模型治療3周a無水乙醇組 1 230±87 1 537±153 0.1%地塞米松組 402±89b 348±68b 0.1%他克莫司組 573±57b 439±59b 0.5%苯烯莫德組 892±55b 955±128b 1.0%苯烯莫德組 871±45b 865±79b 2.0%苯烯莫德組 798±43b 845±81b

討 論

ACD是皮膚或黏膜單次或多次接觸外源性物質后，經12～48 h在接觸部位甚至接觸以外的部位發生的炎癥性疾病。發病機制屬于接觸性超敏反應(contact hypersensitivity，CHS)。 CHS是針對半抗原發生的T細胞介導的皮膚免疫反應，一般認為CHS屬于遲發型超敏反應(delayed type hypersensitivity，DTH)的一種[6]。DNFB 誘導下的小鼠ACD模型是研究變應性接觸性皮炎的經典模型[7]，已有數十年的歷史。該皮炎模型以耳廓作為研究的靶位，研究者根據炎癥后耳廓的厚度及單位面積的炎癥細胞數來判斷抗皮炎藥物的療效。

我們在預實驗中發現，外用苯烯莫德對經典ACD小鼠模型(24 h)的治療作用不明顯，至少提示苯烯莫德起效不快。因此我們在急性模型的基礎上，嘗試延長接觸性皮炎的持續時間，模仿慢性ACD，從而觀察藥物長期外用的療效。結果顯示，在用藥后的第1天，即藥物治療24 h后，苯烯莫德各劑量組小鼠雙耳厚度差與無水乙醇組相比，差異均無統計學意義；而0.1%地塞米松組、0.1%他克莫司組的雙耳厚度差分別與無水乙醇組相比顯著降低，說明0.1%地塞米松和0.1%他克莫司短期(24 h)外用即可明顯抑制小鼠耳部的炎癥反應。用藥1周時，苯烯莫德各劑量組耳腫脹程度與無水乙醇組相比顯著降低，藥物作用開始出現，一直持續至3周治療結束時。治療結束時，苯烯莫德各劑量組小鼠雙耳重量差、厚度差及皮損組織病理炎癥細胞計數與無水乙醇組相比均顯著降低。可見苯烯莫德的起效時間與0.1%地塞米松和0.1%他克莫司相比較晚，短期(24 h)療效不佳；0.1%地塞米松起效最迅速，用藥24 h后(每天2次)即可明顯改善小鼠耳腫脹程度；0.1%他克莫司在改善耳部皮膚腫脹程度和炎癥細胞浸潤方面，與0.1%地塞米松療效相當。苯烯莫德在大約1周左右才開始起效，且療效一直持續至3周后治療結束時。由此，我們推測苯烯莫德可能是通過與上述兩種藥物不同的藥理學機制而起作用。在為期3周的用藥過程中，3種不同濃度的苯烯莫德治療組均未發現皮損加重、皮膚萎縮、色素沉著、水皰、毛囊炎等藥物不良反應發生，證明苯烯莫德局部應用具有一定的安全性。

[1]Gao JG，Zhang Y，Zheng HT，et al.Synthesis of novel drug Benvitimod[J].Adv Mat Res，2011(236-238)：2378-2382.

[2]Bhol KC，Schechter PJ.Topical nanocrystalline silver cream suppressesinflammatorycytokinesand inducesapoptosisof inflammatory cells in a murine model of allergic contact dermatitis[J].Br J Dermatol，2005，152(6)：1235-1242.

[3]周倩，寇庚，錢衛珠，等.CTLA4-Ig對變應性接觸性皮炎小鼠模型的治療作用[J].中華皮膚科雜志，2002，35(4)：256-259.

[4]van Triel JJ，Arts JH，Muijser H，et al.Allergic inflammation in the upper respiratory tract of the rat upon repeated inhalation exposure to the contact allergen dinitrochlorobenzene(DNCB)[J].Toxicol，2010，269(1)：73-80.

[5]Kim TH，Jung JA，Kim GD，et al.The histone deacetylase inhibitor，trichostatin A，inhibits the developmentof2，4-dinitrofluoro-benzene induced dermatitis in NC/Nga mice[J].Int Immunopharmacol，2010，10(10)：1310-1315.

[6]RossR，Reske-KunzAB.TheroleofNO in contact hypersensitivity[J].Int Immunopharmacol，2001，1(8)：1469-1478.

[7]Honda T，Egawa G，Grabbe S，Kabashima K.Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model：toward the understanding of allergic contact dermatitis[J].J Inves Dermatol，2013，133(2)：303-315.

2013-12-04)

(本文編輯:尚淑賢)

Effect of benvitimod on allergic contact dermatitis in BALB/c mice

Qian Jiali，Xu Hongjun，Zhao Yan，Sun Qingmiao，Ma Xiaolei，Huang Haiyan，Zhang Jianzhong*.*Department of Dermatology，Peking University People's Hospital，Beijing 100044，China

Zhang Jianzhong，Email：rmzjz@126.com

ObjectiveTo evaluate the efficacy of benvitimod on allergic contact dermatitis(ACD)in a mouse model of allergic contact dermatitis.MethodsAcute and chronic ACD models were established respectively in 42 BALB/c mice through 2，4-dinitrofluorobenzene(DNFB)sensitization and challenge.Then，the BALB/c mice were equally divided into 7 groups with 6 mice in every group：normal control group receiving no treatment，five treatment groups topically treated with 0.1%dexamethasone solution，0.1%tacrolimus(FK506)solution，0.5%benvitimod solution，1.0%benvitimod solution and 2.0%benvitimod solution respectively，and dehydrated alcohol group treated with dehydrated alcohol only.All the drug solutions were topically applied at 24 and 36 hours after the last challenge in the murine models of acute ACD which were sacrificed at 48 hours，and twice daily from day 7 to 21 after the initial sensitization in the murine models of chronic ACD which were sacrificed on day 21 after the first topical treatment.Ear tissues were obtained from these mice and subjected to measurement of ear thickness and weight，as well as pathological examination and evaluation of inflammatory infiltrate by hematoxylin-eosin(HE)staining.The safety of these drugs was also estimated at the end of treatment.ResultsIn the murine models of acute ACD，benvitimod showed no obvious therapeutic effect at 24 hours，with no significant differences in bilateral difference in ear thickness or weight between the three benvitimod groups and dehydrated alcohol group(allP＞0.05).Meanwhile，in the murine models of chronic ACD，benvitimod markedly decreased the swelling degree of ears，with significant differences between the three benvitimod groups(0.5%，1.0%and 2.0%)and dehydrated alcohol group in bilateral difference in ear thickness((71.50±3.15)×10-3mm，(75.50±3.02)×10-3mm and(69.50±2.59)×10-3mm vs.(91.83±2.04)×10-3mm，allP＜0.01)and weight((2.33±0.45)mg，(2.30±0.57)mg and(2.38±0.27)mg vs.(3.73±0.33)mg，allP＜0.01)after 3 weeks of treatment.The inflammatory infiltration in ear tissue was significantly attenuated in murine models of both acute and chronic ACD by the three concentrations of benvitimod compared with dehydrated alcohol(allP＜0.01).Conclusions Topical benvitimod can inhibit chronic ACD in mice induced by 2，4-DNFB，but exhibits no obvious effect on acute ACD.No apparent local adverse effects were observed during the treatment with benvitimod in these mice.

Benvitimod；Dermatitis，allergic contact；Disease models，animal

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.012

100044北京大學人民醫院皮膚科[錢佳麗(現在北京中醫醫院順義醫院皮膚科，101300)、趙琰、孫青苗、馬曉蕾、黃海艷、張建中]；民航總醫院皮膚科(徐宏俊)

張建中，Email:rmzjz@126.com