缺氧誘導因子1α在肢端惡性黑素瘤組織中的表達

周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

缺氧誘導因子1α在肢端惡性黑素瘤組織中的表達

周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

目的探討缺氧誘導因子(HIF)1α在肢端惡性黑素瘤(MM)中的表達及其與干細胞因子(SCF)/c-kit途徑的關系。方法應用免疫組化法檢測HIF-1α在93例MM、21例非肢端MM、39例肢端色素痣組織中的表達，并用15例肢端正常皮膚組織作對照。同時檢測c-kit在93例肢端MM組織中的表達情況，采用Spearman相關分析，分析其與HIF-1α的相關性。結果在93例肢端MM中，81例(87.10%)陽性表達HIF-1α，在21例非肢端MM中19例(90.48%)陽性，39例肢端色素痣中6例(15.38%)陽性；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚和肢端色素痣相比較，肢端MM中HIF-1α的表達增高，差異有統計學意義(均P＜0.01)；在肢端MM和非肢端MM組間，HIF-1α表達差異有統計學意義(P＜0.01)。HIF-1α表達水平與黑素瘤Clark分級、Breslow厚度分級均呈正相關(rs=0.442，P＜0.01；rs=0.368，P＜0.01)。在原位、侵襲性、轉移性肢端MM組織中，HIF-1α表達水平與腫瘤進展呈正相關(rs=0.420，P＜0.01)。在肢端MM中，HIF-1α表達與c-kit表達呈正相關(rs=0.307，P＜0.01)。結論HIF-1α蛋白在肢端MM中呈高表達，且與腫瘤的分期、進展、侵襲性均呈正相關，與c-kit在肢端MM組織中的協同表達，提示可能共同參與肢端MM的發病機制。

黑色素瘤；缺氧誘導因子1，α亞基；原癌基因蛋白質c-kit

皮膚惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，致死率高，研究發現不同的人種中黑素瘤的發生率、臨床表現、組織學亞型和基因改變不盡相同，亞洲人種以肢端黑素瘤為主，而腫瘤位于肢端，提示其發生可能與肢端的缺氧微環境相關。眾所周知，組織缺氧是腫瘤微環境基本特征之一，與腫瘤的發生、發展有關，缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1α是腫瘤缺氧反應中關鍵性因子，既往文獻報道其在多種腫瘤中表達升高，與其中某些腫瘤的惡性程度及患者死亡率明顯相關[1-4]。在乳腺癌及胰腺癌中發現HIF-1α和干細胞因子(stem cell factor，SCF)通過SCF/c-kit途徑誘導腫瘤血管生成及侵襲性增加[5-6]，而在黑素瘤中的相關研究報道較少[2，7]。我們推測在肢端黑素瘤中，可能存在低氧狀態誘導HIF-1α高表達及SCF/c-kit途徑的異常活化，為進一步探討HIF-1α在肢端黑素瘤發病機制中的作用及其與SCF/c-kit途徑的聯系，我們選擇肢端MM組織，觀察皮損中HIF-1α、c-kit的表達。

資料與方法

1.標本:收集2010年1月至2013年6月期間在中國醫學科學院皮膚病醫院經臨床及病理證實的肢端MM 93例，非肢端MM 21例，肢端色素痣39例，肢端正常皮膚組織15例。93例肢端MM患者中，女56例，男37例；發病年齡29～90歲，平均年齡59.94歲；原位腫瘤28例，侵襲性腫瘤58例，轉移性MM 7例；Clark分級Ⅰ～Ⅱ級38例，Ⅲ～Ⅴ級55例。21例非肢端MM患者中，女10例，男11例；發病年齡24～87歲，平均年齡62.99歲；原位腫瘤5例，侵襲性腫瘤16例；ClarkⅠ～Ⅱ級6例，Ⅲ～Ⅴ級15例。肢端色素痣39例，其中發育不良痣5例，普通良性痣34例。

2.標本處理:所有標本經4%甲醛固定、常規脫水、石蠟包埋；4 μm厚度切片后常規HE染色或敷貼于10%多聚賴氨酸預先處理的載玻片上，用于免疫組化實驗。

3.試劑及儀器:鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(ab1)產自英國Abcam公司(工作濃度為1∶100)，即用型鼠抗人c-kit單克隆抗體、即用型羊抗鼠二抗、3，3-二氨基聯苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒均產自福州邁新生物技術開發有限公司。顯微鏡工作臺及照相系統為日本Nikon公司產品。

4.免疫組化法:石蠟切片脫蠟脫水；Tris-EDTA緩沖液(0.01 mol/L，pH9.0)高溫高壓修復 3 min，室溫自然冷卻；后分別滴加抗HIF-1α抗體和抗c-kit抗體(其中抗c-kit抗體只在肢端MM組織切片中滴加)；濕盒中4℃過夜；再滴加二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。用PBS代替一抗作陰性對照，用人卵巢鱗狀上皮細胞癌作HIF-1α染色陽性對照，用肥大細胞瘤作c-kit陽性對照。所有組織染色條件相同。

5.結果判定:判定標準:腫瘤細胞核呈棕褐色顆粒著色為陽性細胞。高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，計數全部有核細胞，分別計算切片中著色強度和著色陽性細胞的百分率。著色強度:強著色為3分，中等著色為2分，弱著色為1分，不著色或著色不清為0分；著色陽性細胞的百分率＞50%為3分，10%～50%為2分，＜10%為1分，不著色為0分，最后將所計的分數相乘得出最終的免疫組化積分。組化積分0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，＞6分為(+++)[8]。結果判定由2名皮膚病理醫生獨立進行。

6.統計學分析:應用SPSS17.0統計軟件包分析。計數資料比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗；HIF-1α和腫瘤進展、腫瘤分級及c-kit蛋白間相關性研究用Spearman相關檢驗。檢驗水準α均為0.05。

結 果

圖1 缺氧誘導因子(HIF)1α和c-kit在肢端侵襲性黑素瘤中的表達(DAB染色×200) 1a:HIF-1α染色；1b:c-kit染色 圖2 HIF-1α在良性色素痣中的陰性表達(DAB染色×100) 真皮淺層痣細胞成巢區域分布較多色素顆粒

1.HIF-1α蛋白的表達:免疫組化結果顯示(圖1a)，在93例肢端MM中，陽性表達81例(87.10%)。21例非肢端 MM中，19例陽性(90.48%)；其中，5例原位腫瘤中3例陽性；16例侵襲性腫瘤中7例陽性(43.75%)。在39例色素痣(圖2)中6例陽性(15.38%)；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚組和肢端色素痣組比較，肢端MM組中HIF-1α的蛋白表達水平差異均有統計學意義(χ2=52.258，62.889，均P＜ 0.01)；在侵襲性MM中，肢端組中HIF-1α的蛋白表達水平顯著高于非肢端組，差異具有統計學意義(χ2=24.081，P＜0.01)，在原位MM中，兩組的蛋白表達水平差異無統計學意義(χ2=0.118，P＞0.05)。

2.HIF-1α蛋白表達與肢端MM患者臨床特征及腫瘤侵襲和轉移的關系(表1):93例肢端MM中，HIF-1α表達水平在Clark分級Ⅰ～Ⅱ級組與Ⅲ～Ⅴ級組間、有/無潰瘍組間差異有統計學意義(均P＜0.05)，而在不同性別組間、Breslow厚度0～2 mm組與厚度＞2 mm組間、有/無炎細胞浸潤組間差異無統計學意義(均P＞0.05)。在原發、侵襲性、轉移性肢端MM組織中，HIF-1α表達水平與腫瘤進展呈正相關(rs=0.420，P＜ 0.01)；HIF-1α 表達水平與腫瘤Clark分級、Breslow厚度分級均呈正相關(rs=0.442，P＜ 0.01；rs=0.368，P＜ 0.01)。

3.肢端MM中HIF-1α蛋白與c-kit表達的相關性(表2):93例肢端MM中，84例表達c-kit，其中 42例(圖 1b)(+++)，33例(++)，9例(+)，9例不表達；經Spearman相關分析，HIF-1α與c-kit表達呈正相關(rs=0.307，P＜ 0.01)。

討 論

皮膚MM發生于人體的最外層組織，即距離中心循環系統最遠、相對缺氧的皮膚組織內[9]，而肢端皮膚缺氧程度較其他部位皮膚更甚，提示缺氧在肢端皮膚黑素瘤的發生中可能起到一定作用。

表1 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中缺氧誘導因子1α表達與臨床特征的關系

亞洲人種以肢端MM為主，提示其發生可能與肢端的缺氧微環境相關。缺氧可以促進腫瘤的生長、侵襲和轉移，且影響患者預后。腫瘤對缺氧的反應主要通過轉錄調節HIF-1α的水平來實現[1]。HIF-1α調節細胞對氧壓力的適應性，影響腫瘤細胞的重塑、代謝、增殖、存活、侵襲、凋亡及血管形成中等相關基因的表達[1-2，10]。HIF-1α在乳腺癌、腸癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤均有高表達，且與腫瘤的惡性進展相關[2-3，11]。此外，研究亦發現HIF-1α還可誘導腫瘤對治療的抵抗，減弱機體抗腫瘤的適應性免疫，而HIF-1α表達越高，患者預后及對治療的反應越差[12-13]。以上研究均提示HIF-1α在腫瘤形成和進展中有重要的作用，為腫瘤的治療同樣提供了新的靶點。

表2 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中HIF-1α表達與腫瘤進展、分期及c-kit表達間的相關分析

缺氧條件下，腫瘤內HIF-1α蛋白水平升高，一方面，其可與SCF啟動子中功能性缺氧反應元件(hypoxia-response element，HRE)區域相結合，從而活化SCF及其受體c-kit，激活下游PI3K/Akt通路，引起腫瘤細胞的增殖、血管形成，并增加侵襲相關基因的表達[6，14]。 另一方面，Monsel等[7]發現，HIF-1α還可使含有突變型c-Kit基因的黑素瘤細胞增殖活化，亦能激活下游PI3K/Akt通路，激活腫瘤的一系列生物學行為。

我們的研究發現，在肢端MM中，HIF-1α蛋白的表達水平明顯高于肢端良性色素痣，且與腫瘤的分期、進展、侵襲性均呈正相關，提示HIF-1α在肢端MM組織中高表達，可能參與肢端MM的發病機制；在侵襲性腫瘤中，肢端MM中HIF-1α蛋白的表達高于非肢端MM，提示肢端部位腫瘤進展和缺氧微環境的關系較非肢端部位的腫瘤更密切。我們的研究還發現，在肢端MM中，HIF-1α與c-kit蛋白表達水平呈正相關，進一步佐證了HIF-1α與c-kit基因的表達在誘導黑素瘤細胞活化、增殖等方面具有協同作用。目前，關于HIF-1α在腫瘤，特別是肢端MM發病機制方面的研究仍較廣泛，具體機制尚不明確，提示可能通過多條途徑影響腫瘤的發病過程。而HIF-1α與c-kit在肢端MM組織中的協同表達，提示在抗腫瘤治療中，也許可以聯合應用HIF-1α與c-kit的拮抗劑，從而為黑素瘤的治療提供新的治療策略。

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2014-01-17)

(本文編輯:尚淑賢)

Expression of hypoxia-inducible factor-1α in acral malignant melanoma tissue

Zhou Lu，Hu Bin，Huang Yingxue，Shao Xuebao，Li Amei，Chen Hao，Sun Jianfang*.*Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s：Chen Hao，Email：ch76ch@163.com；Sun Jianfang，Email：sunjf57@163.com

ObjectiveTo measure the expression of hypoxia-inducible factor(HIF)-1α in acral malignant melanoma(MM)tissue and to investigate its relationship with the stem cell factor(SCF)/c-kit pathway.MethodsImmunohistochemical staining was performed to measure the expression of HIF-1α in tissue specimens from lesions of 93 patients with acral MM，21 with non-acral MM，39 with acral melanocytic nevi，and from the normal acral skin of 15 healthy human controls.Meanwhile，the expression of c-kit was detected by immunohistochemical staining in the 93 acral MM tissue specimens.Statistical comparisons were carried out by chi-square test and Mann-WhitneyUtest.The relationship of HIF-1α expression with c-kit expression as well as tumor progression and staging was assessed by Spearman correlation analysis.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression rate of HIF-1α was 87.10%(81/93)in acral MM specimens，90.48%(19/21)in non-acral MM specimens，15.38%(6/39)in acral melanocytic nevus specimens，but 0(0/15)in the normal acral skin specimens.The expression of HIF-1α was significantly higher in acral MM lesions than in normal acral skin and acral melanocytic nevus lesions(bothP＜0.01)，and significantly different between acral MM and non-acral MM lesions(P＜ 0.01).Moreover，HIF-1α expression was positively correlated with Clark level and Breslow depth of melanoma(rs=0.442，0.368，respectively，bothP＜ 0.01)，with the progression of acral MM(fromin situto aggressive and metastatic MM)(rs=0.420，P＜ 0.01)，and with the expression of c-kit(rs=0.307，P＜ 0.01).Conclusions HIF-1α is highly expressed in acral MM，positively correlated with the staging，progression and aggression of MM，and co-expressed with c-kit in acral MM tissue，suggesting that both HIF-1α and c-kit take part in the pathogenesis of acral MM.

Melanoma；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.002

國家自然科學基金(81102067)

210042南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所[周璐(現在青島大學附屬醫院皮膚科，266000)、胡彬、黃瑩雪、邵雪寶、李阿梅、陳浩、孫建方]

陳浩，Email:ch76ch@163.com；孫建方，Email:sunjf57@163.com