肝癌患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜的研究

刁振琦，李云濤，熊 洋，饒鳳飛，張建民，唐偉躍

(鄭州大學物理工程學院，河南 鄭州450001)

肝癌是第5 大常見的惡性腫瘤，占腫瘤致死原因的第3 位，其5 a 自然死亡率超過95%［1］。中國占全世界肝癌病例的45%［2］。因此肝癌在世界各地都極受關注。肝癌的創痛治療方法是手術、化療。肝癌的早期發現對治療后的生存率有極大幫助，因此，探索肝癌的早期診斷有重大意義。本文利用健康人、肝癌患者和肝癌術后患者的氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜，研究肝癌的早期診斷。

紫外-可見吸收光譜屬于分子光譜，是由于價電子的躍遷而產生的。紫外-可見吸收光譜具有以下3點性質:1)對于同一種物質，濃度越大，吸收強度也越大;2)對于同一物質，同一濃度待測溶液，對不同波長的吸收強度會呈現出不同的狀況;3)對于同一物質，最大吸收峰位置與物質的濃度無關，吸收譜的形狀完全相同［3］。

紫外-可見吸收光譜的應用非常廣泛，常見的應用是對物質進行定量分析，對常量、微量、多組分進行測定;也可根據物質吸收峰的特性來對進行定性分析和結構分析。

血液是有血漿和血細胞組成。血漿為淺黃色半透明液體，其中除含大量水分外，還含有無機鹽、白蛋白、球蛋白、酶和各種激素等;血細胞由人體造血器官產生，分為紅細胞、白細胞和血小板。紅細胞有一定的彈性和可塑性，直徑在7 ～8.5 μm 之間，呈雙凹圓盤狀，中央較薄，邊緣較厚。成熟的紅細胞無細胞核和細胞器，里面充滿了血紅蛋白，血紅蛋白是含鐵的蛋白質，約占紅細胞質量的33%，具有運輸與結合氧氣和二氧化碳的功能。氧合血紅蛋白是血紅蛋白和氧分子的結合物，是一種亮紅色的血紅蛋白和氧的化學合成物，把氧氣運輸到人體組織中。

1 試驗儀器與材料

儀器:小型臺式離心機TGL216G，紫外-可見吸收光譜儀(UV-101，日本Shimadzu 公司)，電子掃描顯微鏡(S-505，荷蘭Philips 公司);電子透射顯微鏡(H-606，日本Hitachi 公司)，便攜式拉曼光譜儀(R-3000TM，美國Ocean Optics 公司)。

血液樣品:30 例健康人、40 例肝癌患者和30 例肝癌術后患者血液樣本均采集于鄭州大學人民醫院和鄭州大學腫瘤醫院。

化學試劑(質量分數):硝酸銀(99.8%)，聚乙烯醇(95%)，濃硫酸(98%)，銀棒(99. 9%)，雙氧水(30%)，氨水(28%)，去離子水(18.0 MΩ·cm)，載玻片。

2 方法與結果

2.1 提取氧合血紅蛋白 取自健康人、肝癌患者和肝癌術后患者的新鮮血液樣品每例3 mL，不加任何抗凝劑，在37 ℃室溫中放置1 h 左右使其凝結。然后用小型臺式離心機5 000 r·min-1離心5 min，使之分層，提取下層紅細胞，然后將提取的紅細胞按體積比為1∶10 加入到去離子水中，使之溶血。之后再次使用小型臺式離心機5 000 r·min-1離心5 min，提取中間溶液即氧合血紅蛋白溶液，放置于冰箱中，0 ～4 ℃保存待測。

2.2 健康人、肝癌和術后患者氧合血紅蛋白紫外－可見吸收光譜 檢測了30 例健康人、40 例肝癌患者及30 例術后患者氧合血紅蛋白的紫外-可見吸收光譜。

健康人紫外-可見吸收光譜在413 nm 處出現譜峰，而在肝癌和術后患者紫外-可見吸收光譜中，此譜峰位置分別平移到了410 nm 和412 nm 處。而在541、576 nm 處沒有出現譜峰平移的情況。健康人、肝癌術后患者和肝癌患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰附近強度基本呈現出依次增強的情況;而在541、576 nm 處，健康人、肝癌患者和肝癌術后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜譜峰強度基本相同;在413 nm-1附近，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強度普遍要比健康人高很多。見圖1。

在正常生理條件下(37 ℃，pH 7.4)，氧合血紅蛋白在541 nm 和576 nm 處附近有特征吸收峰，吸收峰的高度不僅與紅細胞內氧合血紅蛋白溶液濃度的高低有關，而且還與血紅蛋白的理化性質(如溶解性穩定性和氧化狀態等)有關;吸收峰的位置與不同攜氧能力下氧合血紅蛋白的構型有關［4-5］，413 nm 附近對應于血紅蛋白的特征峰。541 nm 和576 nm 特征吸收峰的峰高、峰位和峰形反映了氧合血紅蛋白分子的濃度分子結構的變化及輸氧功能的強弱，吸收峰強弱以及峰行的變化反應了氧合血紅蛋白分子機構的變化［4］。在413 nm 處附近，健康人、肝癌患者和術后患者呈現出明顯不同的光譜強度，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強度普遍要比健康人高很多，肝癌術后患者也比健康人譜峰強度高，可以表明肝癌患者血液中血紅蛋白的含量可能高于健康人，肝癌術后患者血紅蛋白含量低于肝癌患者，其血液中血紅蛋白含量在降低。見圖1。

圖1 健康人(黑色)、肝癌(紅色)和肝癌術后(粉紅色)和紫外-可見吸收光譜

3 討論

實驗中檢測了健康人、肝癌及術后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜，分析發現肝癌及術后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰位置出現平移，分別平移到410 nm 和412 nm 處。健康人、肝癌術后患者和肝癌患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜在413 nm 譜峰附近強度基本呈現出依次增強的情況;而在541、576 nm 處，健康人、肝癌患者和肝癌術后患者氧合血紅蛋白紫外-可見吸收光譜譜峰強度基本相同;在413 nm 處附近，肝癌患者紫外-可見吸收光譜的強度普遍要比健康人高很多，肝癌術后患者也比健康人譜峰強度高，可以表明肝癌患者血液中血紅蛋白的含量可能高于健康人，肝癌術后患者血紅蛋白含量低于肝癌患者;相對于肝癌患者，肝癌術后患者血液中血紅蛋白含量在降低。

［1］徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等. 改變肝癌早期診斷和治療現狀的新肝癌血清標志物［J］. 基礎醫學與臨床，2008，28(1):104-108.

［2］李根叢，陸才德.肝癌治療的現狀及發展前景［J］.現代實用醫學，2005，17(6):319 -321.

［3］李建軍，丁正生，張海燕.常用判別分類方法分析［J］.西安科技大學學報，2007，27(1):138 -142.

［4］Tsujita K，Shiraishi T，Kakinuma K. Microspectrophotometry of nitric oxide-dependent changes in hemoglobin in single red blood cells incubatedwith stimulated macrophages［J］. J Biochem，1997，122(2):264 -270.

［5］魏英耐，陳長青，李云濤，等. 不同劑量電子線照射宮頸癌細胞后紅外光譜的統計分析［J］.腫瘤基礎與臨床，2013，26(3):216-220.