YAP蛋白在甲狀腺髓樣癌組織中的表達

樊玉霞，劉 洋，劉 征，王曉明，袁青領，盧秀波

(鄭州大學第一附屬醫院甲狀腺外科，河南 鄭州450052)

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)占甲狀腺癌的5% ～10%，起源于甲狀腺濾泡旁細胞［1］。據報道，MTC 預后較差，超過50%的MTC 患者就診時已有頸部淋巴結轉移，5 a 生存率為25%，10 a生存率為10%，嚴重威脅著人類的健康和生命。目前MTC 發病機制尚不清楚，探索其發生發展中的關鍵致病因素，尋找早期診斷的腫瘤標志物及有效的分子治療靶點對MTC 的早期診斷及治療至關重要。YAP 蛋白是調控細胞增殖與凋亡的重要蛋白，在多種惡性腫瘤發生發展中具有重要促進作用［2］。本研究應用免疫組織化學技術檢測YAP 蛋白在MTC 組織中的表達，初步探討YAP 蛋白在MTC 組織中的表達情況及意義，為MTC 的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及主要試劑 50 例甲狀腺組織標本均選自鄭州大學第一附屬醫院病理科2012年5月至2014年5月隨訪資料完整的手術切除標本，其中包括25 例MTC(男9 例，女16 例，年齡17 ～66 歲，中位年齡49 歲)和25 例正常甲狀腺組織(男10 例，女15 例，年齡16 ～69 歲，中位年齡48 歲)。所有MTC 患者術前未經過任何抗腫瘤治療。所有標本均得到2 位以上的病理學專家證實。標本獲取后均常規質量分數4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制片。實驗用兔抗人YAP 蛋白單克隆抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司，HRP 標記的抗兔鼠通用型Polymer Kit 和DAB 酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 免疫組織化學染色 采用免疫組織化學方法檢測YAP 蛋白在MTC 和正常甲狀腺組織中的表達。切片經過二甲苯常規脫蠟，梯度酒精和蒸餾水水化后，質量分數0.3% H2O2孵育15 min 封閉內源性過氧化物酶，并用EDTA 進行抗原修復。加兔抗人YAP 單克隆抗體(工作濃度1∶100)孵育，4 ℃過夜。PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。加入HRP 標記的二抗，室溫孵育20 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。DAB 顯色2 ～5 min，蘇木素輕度復染，沖洗。中性樹膠封片。以PBS 緩沖液替代一抗為陰性對照。

1.3 免疫組化的結果判定 陽性細胞數聯合染色強度進行評分，采用半定量積分法判斷結果。陽性細胞數:≤5%為0 分，＞5% ～25%為1 分，＞25% ～50%為2 分，＞50% ～75%為3 分，＞75%為4 分;陽性細胞染色強度:無色為0 分，淺黃色為1 分，黃色為2 分，深黃或棕褐色為3 分。將2 項積分相乘為最終評分，＜4 分為陰性表達，≥4 分為陽性表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0 進行統計分析，率的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

25 例MTC 組織中YAP 蛋白陽性表達率為88.00%(22/25)，陽性信號主要定位于細胞核和細胞漿，染色程度主要為中等或強陽性;而25 例正常甲狀腺組織中YAP 蛋白表達均為陰性，2 組YAP 蛋白陽性表達率比較差異有統計學意義(χ2= 39. 286，P ＜0.05)。見圖1。

圖1 YAP 蛋白在MTC 組織中的表達(200 ×)(A、B、C)

3 討論

MTC 的發生發展是一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程，與細胞的增殖、凋亡等密切相關。然而目前為止，MTC 發病機制尚不清楚，從分子水平對MTC的發生進展進行研究，對于該惡性腫瘤的診治及預防具有重要意義。各種腫瘤發生發展的基礎是癌基因激活和抑癌基因的突變或失活，YAP 是細胞凋亡信號傳導通路上的重要基因，有報道稱當YAP 基因突變時，將使細胞異常增生而導致腫瘤發生，因此YAP 被稱為是一種候選的癌基因。

YAP 蛋白是Hippo 信號通路中的核心成員，該通路主要調節細胞增殖、凋亡，在胚胎發育及器官形成過程中起著重要作用［3］。Hippo 信號通路激活時，YAP被磷酸化，不能發揮生物學作用，當Hippo 信號通路受到抑制時，YAP 蛋白不被磷酸化，可以進入細胞核內，進而激活下游基因，調控靶基因轉錄［4］。YAP 在多種惡性腫瘤中呈明顯過表達。Tsujiura 等［5］的研究顯示YAP 在子宮內膜癌組織中呈過表達，且抑制子宮內膜癌細胞中YAP 的表達可抑制腫瘤細胞生長。Perra等［6］通過構建動物模型發現，在肝癌發生早期即可出現YAP 過表達，并可作為肝癌潛在的治療靶點。Avruch 等［7］研究發現，YAP 可促進結腸癌細胞增殖及有望成為治療結腸癌新靶點。此外，Xia 等［8］報道YAP 可以促進卵巢上皮細胞向間質演變，進而促使卵巢癌細胞生長和腫瘤的生成。本研究發現YAP 蛋白在MTC 組織中呈明顯過表達，表明YAP 與MTC 蛋白的發生發展密切相關，但其具體的調控機制不清楚，尚有待于進一步研究。

綜上所述，YAP 蛋白在MTC 組織中呈過表達，表明YAP 蛋白可能與MTC 的發生發展密切相關，有望成為具有潛在應用價值的分子標記及治療靶點。但是YAP 蛋白在MTC 發生發展中的具體作用及機制還不明確，深入研究YAP 蛋白信號通路與MTC 的關系將是我們下一步研究的重點。

［1］Maia AL，Siqueira DR，Kulcsar MA，et al.Diagnosis，treatment，and follow-up of medullary thyroid carcinoma:recommendations by the Thyroid Department of the Brazilian Society of Endocrinology and Metabolism［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol，2014，58(7):667-700.

［2］Kim SK，Jung WH，Koo JS. Expression of Yes-associated protein(YAP)in breast phyllodes tumor［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7(9):5997 -6005.

［3］Tariki M，Dhanyamraju PK，Fendrich V，et al. The Yes-associated protein controls the cell density regulation of Hedgehog signaling［J］.Oncogenesis，2014，3:e112.

［4］Gumbiner BM，Kim NG. The Hippo-YAP signaling pathway and contact inhibition of growth［J］.J Cell Sci，2014，127(Pt 4):709 -717.

［5］Tsujiura M，Mazack V，Sudol M，et al. Yes-associated protein(YAP)modulates oncogenic features and radiation sensitivity in endometrial cancer［J］.PLoS One，2014，9(6):e100974.

［6］Perra A，Kowalik MA，Ghiso E，et al.YAP activation is an early event and a potential therapeutic target in liver cancer development［J］.J Hepatol，2014，61(5):1088 -1096.

［7］Avruch J，Zhou D，Bardeesy N. YAP oncogene overexpression supercharges colon cancer proliferation［J］.Cell Cycle，2012，11(6):1090 -1096.

［8］Xia Y，Chang T，Wang Y，et al.YAP promotes ovarian cancer cell tumorigenesis and is indicative of a poor prognosis for ovarian cancer patients［J］.PLoS One，2014，9(3):e91770.