絲裂霉素膀胱灌注對膀胱癌細胞端粒酶活性的影響

解放軍第四六三醫院泌尿外科(110042)劉興凱 姜泰茂 石岐興

劉冬燁 張 勇 張 樂

在我國，男性膀胱癌位居全身腫瘤的第8位，其發病率遠較西方國家低［1］。臨床上膀胱癌以淺表性腫瘤為多見，約為70%～80%，淺表性膀胱癌患者手術后復發率較高，3年內復發率可達40%～70%［2］。膀胱癌采用化療藥物灌注是目前預防淺表性膀胱癌術后復發的重要措施。由于端粒酶在腫瘤組織中較正常組織明顯高表達，因此具有腫瘤標記物的作用，可用于惡性腫瘤的檢測［3-4］，因此可以選擇端粒酶作為評價化療藥物灌注效果的指標。我院于2008年6月～2010年6月，采用絲裂霉素對一組膀胱移行細胞癌患者進行術前膀胱灌注，通過檢測膀胱灌注前后腫瘤細胞端粒酶活性變化，從細胞和分子水平探討絲裂霉素對膀胱腫瘤的作用及機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 膀胱移行上皮細胞癌患者50例，均經病理證實。男29例，女21例。年齡35～86歲，平均70.4歲。臨床分期:T1期28例，T2期18例，T3期4例。細胞分級:Ⅰ級26例，Ⅱ級17例，Ⅲ級7例。采用經尿道膀胱腫瘤電切術30例，膀胱部分切除術13例，膀胱全切尿流改道7例。術前膀胱鏡檢查時留取腫瘤標本。術前1周用絲裂霉素20mg經導尿管緩慢注入膀胱，囑患者分別仰臥、左右側臥及俯臥，每15分鐘變換一次體位，保留藥物2小時。隔天灌注l次，共3次。手術留取腫瘤標本，部分標本離體后l小時內液氮速凍，置-80℃冰箱保存(＜3個月)，部分標本以10%甲醛固定、石蠟包埋。

1.2 研究方法 端粒酶檢測試劑盒購自德國Roche公司;PCR擴增儀為美國PE公司;酶標檢測儀為美國Gene公司產品;冷凍高速離心機為日本HITACH公司。采用端粒重復序列擴增法(TRAP-PCRELISA)對速凍膀胱癌組織的端粒酶活性進行相對定量測定，操作方法簡述如下:1)端粒酶提取:取膀胱癌組織標本50mg在200μL預冷的裂解液中勻漿化，置碎冰中作用30分鐘，在4℃下16000r/min離心20分鐘，取上清液保存于-80℃備用。2)TRAPPCR擴增:取待測樣品50μg用25μLPCR反應混合液，加入2μL蛋白提取液。再加入無菌雙蒸水至50μL，在PCR擴增儀上進行引物延伸與DNA擴增。實驗參數如下:引物延伸，25℃20分鐘;端粒酶滅活，94℃5分鐘;擴增條件為:變性94℃30秒，復性50℃30秒，延伸72℃90秒，共30個循環，再72℃延伸10分鐘。3)產物雜交和ELISA檢測:取5μL擴增產物，加入20μL變性試劑，在25℃下孵育10分鐘，再加入225μL雜交緩沖液混勻。取上述混合液，每孔100μL加入用親和素預包被的微量反應板的各孔中。300r/min搖床37℃培養2小時。甩凈雜交液，250μL洗液每次30秒洗3次，甩干。每孔加入抗DIG-POD工作液100μL，在37℃下300r/min搖床培養30分鐘，甩凈孔內液體，加入100μL TMB底物溶液，在室溫下顯色15分鐘。每孔加入100μL終止液，用酶標分析儀測定標本450nm波長吸收值(A)。

1.3 判斷標準 端粒酶活性測定:使用酶標儀，測定加入終止液后30分鐘內其在波長450nm的吸收值，對照試劑盒內標的吸收值和控制模板的吸收值，得到相對定量數值。

1.4 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以()表示，組間比較采用t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

膀胱灌注前后膀胱癌組織的端粒酶活性分別為(12.84±3.53)和(3.88±1.03)，灌注后膀胱癌組織的端粒酶活性明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)。

將端粒酶活性降低作為所要分析的變量，將患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數量、病理分級、臨床分期、發作次數及預后情況分別作為分組變量，進行統計學分析，結果表明，膀胱灌注前后端粒酶活性降低情況與患者年齡、性別、腫瘤數量、病理分級、發作次數無關(P＞0.05)。端粒酶活性降低在腫瘤直徑＞3cm組與≤3cm組之間，臨床分期為T2～T3(浸潤組)與Tis～T1(非浸潤組)之間，復發或轉移組與臨床痊愈組之間的差異有顯著性(P＜0.05)，見表1。

表1 絲裂霉素膀胱灌注前后腫瘤細胞端粒酶變化情況(，OD值)

表1 絲裂霉素膀胱灌注前后腫瘤細胞端粒酶變化情況(，OD值)

注:灌注前后端粒酶活性比較，P＜0.05;在腫瘤大小、臨床分期及預后情況組間比較端粒酶活性變化，P＜0.05。

3 討論

膀胱癌多為淺表性［5］，發病率占男性腫瘤的6%，病死率占2.5%，病因不明［6］。吸煙也是膀胱癌重要的致癌因素，其他如膀胱白斑、腺性膀胱炎、尿石等也可能是膀胱癌的誘發因素。膀胱癌臨床最常見的首發癥狀是肉眼血尿，血尿以間斷性、無痛性為主。膀胱癌的主要治療方法為外科手術。但術后易復發，復發位置多不在原手術部位，因此預防術后復發一般都采用膀胱內藥物灌注治療［7］。絲裂霉素是抗生素類抗腫瘤藥，為細胞周期非特異性藥物，膀胱內極少吸收，藥物可直接作用于膀胱腫瘤細胞，與DNA的雙螺旋結構形成交聯，也能直接作用破壞其DNA鏈，使之斷裂，抑制DNA復制，并有烷化作用。有細胞毒作用，殺死腫瘤細胞，以阻止其復發。

端粒是位于染色體末端的DNA片段，具有穩定染色體結構的功能。端粒酶是重新合成端粒DNA片段的一種核糖核酸蛋白酶，其能維持端粒的長度和功能，使細胞永生化成為癌細胞。端粒酶活性的高低與腫瘤的分化程度有相關性。Hiyama等［8］報道，140例乳腺癌患者中端粒酶陰性者較端粒酶陽性者病程分期早，淋巴結轉移率低，腫瘤體積小。Al-banell等［9］對99例原發性肺癌患者的研究也顯示，腫瘤組織端粒酶活性與腫瘤的臨床生物學行為密切相關。劉興凱等［10］對腎上腺皮質腫瘤中端粒酶的研究表明，端粒酶活性表達反映了腫瘤細胞的惡性行為，端粒酶活性檢測可望成為腎上腺皮質腫瘤良惡性診斷的一種有用方法。Murakami等［11］的研究發現，92%的惡性卵巢腫瘤呈端粒酶陽性，且分化差的惡性腫瘤酶活性明顯高于其他腫瘤。研究證實，膀胱癌組織中端粒酶活性陽性率達為86%～100%，而正常膀胱組織中均呈陰性［12-13］。

膀胱癌的復發［14］和轉移［15］一直是困擾醫學界的難題，而且常常伴隨復發的是級別的升高、浸潤性的增強和轉移的出現。所以如能早期、準確地對有轉移可能的患者進行判斷和監測，發現腫瘤細胞的存在［16］，對治療方案的確立和對預后的評價都有積極的意義，就有可能幫助我們提高患者的5年生存率，延長生命。由于端粒酶在膀胱腫瘤組織表達的普遍性與特異性，本實驗選擇其作為監測膀胱腫瘤治療效果及復發的指標，通過檢測絲裂霉素膀胱灌注前后膀胱腫瘤組織的端粒酶活性，來觀察絲裂霉素對膀胱癌細胞的殺傷作用，證實了化療藥物可明顯抑制端粒酶的表達。因此，本實驗認為，監測抗腫瘤前后端粒酶表達水平，可以為臨床預測膀胱灌注效果，合理選擇抗腫瘤藥物，減少不合適患者的藥物副作用和不必要的資源浪費，為個體化治療提供實驗依據。

從實驗的結果來分析，浸潤性膀胱癌患者絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降顯著低于非浸潤性膀胱癌患者，其差異有顯著性，P＜0.05;腫瘤直徑＞3cm膀胱癌患者絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降顯著低于腫瘤直徑≤3cm膀胱癌患者，差異也有顯著性，P＜0.05。結果說明絲裂霉素膀胱灌注對膀胱腫瘤的殺傷效果與膀胱腫瘤大小和臨床分期有著明確的關系。從以往臨床資料和經驗，并結合文獻報道，肌層浸潤性膀胱癌多存在潛在和明確的轉移［17］，這也是其5年生存率一直很難提高的一個重要原因。根據實驗結果我們發現，在浸潤性膀胱癌患者中膀胱灌注的療效明顯低于非浸潤性膀胱癌患者，該結果與肌層浸潤性膀胱癌更易轉移的現象有明顯相關性。當膀胱腫瘤較大或浸潤至肌層，絲裂霉素膀胱灌注時對腫瘤細胞的持續殺傷作用不完全，因此可能影響效果，表現在端粒酶活性下降幅度較低。

所有膀胱癌患者經過3年隨訪，分為復發或轉移組和臨床治愈組，經統計分析發現，復發或轉移組絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降幅度較小;而臨床痊愈組端粒酶活性下降明顯，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。這表明絲裂霉素敏感者預后佳，證明絲裂霉素對膀胱癌的治療及預防復發有顯著作用，能有效地抑制膀胱癌組織的細胞端粒酶活性，誘導腫瘤細胞凋亡［18］。對于絲裂霉素膀胱灌注后端粒酶活性下降小者，可加強術后檢查監測，必要時行膀胱鏡檢查，若有復發早期發現。同時也可選擇其他化療藥物，如羥喜樹堿、阿霉素等膀胱灌注，或許會取得一定的療效。

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