大腸癌中VEGF、Ki-67和MVD的檢測及其臨床意義

焦亞莉 楊麗娟 朱蕾 陳蕾 霍亞平

實體腫瘤的生長侵襲與轉移依賴于新生血管的生成。對腫瘤血管生成機制的研究，目前主要集中于VEGF家族和具有調節血管生成作用的酪氨酸激酶受體[1]。所有促血管生成因子中，VEGF在血管生成過程中起著關鍵性作用。本研究應用免疫組化方法檢測大腸癌組織及癌旁組織中VEGF、Ki-67的表達，并探討VEGF表達與CD34計數的微血管密度（MVD）的關系，從而評價VEGF在大腸癌發生、發展中的作用。同時觀察Ki-67在腫瘤及瘤旁組織中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集安陽市第六人民醫院和安陽市第二人民醫院2009-2011年資料完整的60例大腸癌根治術標本，患者術前均未經過任何抗腫瘤治療。其中男42例，女18例，中位年齡52歲；有淋巴結轉移者33例，無淋巴結轉移者27例。大腸癌按WHO（2005）分型及有/無淋巴結轉移進行分組。另選取大腸癌癌旁組織20例作為對照組。

1.2 研究方法 全部標本經4%中性甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，HE染色。免疫組化采用SP法。鼠抗人單克隆抗體VEGF、鼠抗人單克隆抗體CD34、鼠抗人單克隆抗體Ki-67及免疫組化試劑盒均購自福建邁新生物技術開發有限公司。以同一條件下染色的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定 VEGF、CD34定位于細胞質，以出現棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性細胞數>10%為（+）。CD34陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇被視為血管。先低倍鏡下全面觀察切片以選擇腫瘤內4個血管著色最密集的區域，在200倍鏡下用網格狀目鏡測微尺計數染成棕色的血管數目，取4個視野的均值作為MVD值。Ki-67以腫瘤細胞核出現明顯的棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數1%～20%為（+），21%～50%為（++），>50%為（+++）。

1.4 統計學處理 應用SPSS 10.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF的表達與臨床病理參數的關系 VEGF在癌組織中的陽性表達率為76.7%（46/60），明顯高于癌旁組織中的35.0%（7/20），兩者比較差異有統計學意義（P<0.01）。VEGF在有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組中的陽性表達率也不同，分別為87.9%（29/33）和63.0%（17/27），兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。在癌組織中，VEGF陽性細胞彌漫并多聚集成團。從整體看，癌旁腸組織中VEGF陽性反應強度和范圍較癌組織明顯減弱。VEGF表達與癌細胞的胞質呈彌漫顆粒狀，見圖1。

圖1 瘤組織中VEGF陽性表達（免疫組化SP法×200）

2.2 Ki-67與臨床病理參數的關系 Ki-67在大腸癌組織中的陽性表達率為73.2%明顯高于癌旁腸組織的20.1%，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。Ki-67陽性表達與有/無淋巴結轉移無關（P>0.05）。Ki-67表達與癌細胞的胞核見圖2。

圖2 瘤組織中Ki-67陽性表達（免疫組化SP法×200）

2.3 VEGF陽性與MVD的相關性 46例大腸癌VEGF陽性表達組的MVD值為（38.32±12.65），14例VEGF陰性表達組為（29.63±9.3），兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。CD34定位于血管內皮細胞質，見圖3。

圖3 微血管CD34陽性表達（免疫組化SP法×200）

3 討論

腫瘤新生血管的生成過程中，VEGF被認為是最重要的促發因子，并與創傷愈合等生理性的新生血管形成有關。研究表明，VEGF具有促進內皮細胞分裂增殖，誘導毛細血管生芽、增加微血管通透性、促進內皮細胞遷移和抑制凋亡等多種作用[2]。VEGF-A可與VEGFR-1及VEGFR-2結合，但主要通過與VEGF-2結合發揮促血管生成作用[3]，缺氧引起細胞缺氧誘導因子1α和2α過表達，繼而活化VEGF基因轉錄。同時突變的K-ras等癌基因、腫瘤抑制基因、一些生長因子及細胞因子等誘導VEGF的表達與分泌。本組研究顯示，VEGF在大腸癌中的表達顯著高于相應癌旁組織的表達（P<0.01）；VEGF陽性表達在有/無淋巴結轉移的大腸癌中有顯著差異（P<0.05），提示VEGF在大腸癌的發生、發展、轉移過程中起重要作用。在肺癌患者組織和血漿中亦被證明VEGF表達水平顯著升高[4-5]，且分期越晚血漿VEGF水平升高越明顯。急性白血病患者血液中的VEGF含量明顯升高，初始發病者較緩解組升高有統計學意義[6]，證明VEGF含量與病情的臨床變化有關，對了解病情、判斷預后有幫助。

腫瘤的生長過程有兩個顯著階段，即從無血管的血管前期緩慢生長階段轉變為有血管的血管期快速增殖階段。隨著腫瘤性血管的增生腫瘤加速生長，血管為腫瘤生長提供營養。實驗證明，腫瘤在無血管時呈線性生長，在血管生長時呈指數生長[7]。目前，MVD檢測方法已成為定量分析腫瘤血管生成的金指標。MVD是一個獨立而重要的預后因素，高MVD提示腫瘤易發生轉移，預后不良[8]。血管亦為腫瘤轉移提供重要的途徑，有血道遠處轉移的患者預后往往較差。多數研究表明，VEGF的表達水平與MVD相關[9]，本組研究中VEGF陽性表達組MVD值顯著高于VEGF陰性組（P<0.05），提示VEGF在大腸癌中可誘導微血管形成。

增殖能力的活躍程度是惡性腫瘤的重要標志之一，判斷腫瘤的增殖能力是鑒別腫瘤的良惡性、提示腫瘤預后的重要指標。相較于高倍鏡下進行核分裂計數，穩定的腫瘤增殖標記分子在免疫組化中的應用被認為是判斷腫瘤增殖能力的可靠技術。Ki-67為細胞增生指數，是目前公認的穩定的腫瘤增殖標記分子[10-11]。本組研究中，Ki-67在大腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（P<0.05），提示Ki-67可用于大腸癌的診斷和腫瘤發生的研究。

綜上所述，大腸癌組織中VEGF、Ki-67的表達明顯高于癌旁腸組織，且VEGF的表達與有/無淋巴結轉移和MVD相關，表明VEGF在腫瘤血管形成、腫瘤發展、轉移中扮演重要角色。VEGF及其受體是抗血管生成靶向治療的主要靶標，VEGF檢測對以VEGF為作用靶點的抗血管生成治療具有明顯的指導意義。

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