嗜線蟲致病桿菌HB310 幾丁質酶基因chi70 的克隆和表達

王永娟，張 杰，南宮自艷，宋 萍，白向賓，王勤英

(河北農業大學植物保護學院，保定 071000)

幾丁質酶是一類可以降解幾丁質的糖苷酶，存在于細菌、真菌、昆蟲、甲殼綱動物以及高等動植物體內。在農業生產中，幾丁質酶可以降解昆蟲體內圍食膜中的幾丁質，破壞昆蟲保護屏障，從而為其他昆蟲病原生物侵入到昆蟲體內提供便利，提高昆蟲感染率和死亡率，研究表明，幾丁質酶可以作為增效因子增強Bt 的毒力(Arora et al.2003)。幾丁質酶也可抑制真菌孢子萌發和菌絲生長，從鏈霉菌中分離到的幾丁質酶能抑制曲霉菌絲的生長(Frank et al.，2005);從熒光假單胞菌中分離的幾丁質酶對棉花枯萎病菌有抑制作用(Naosekpam et al.，2006)。Chen 等從昆蟲病原線蟲共生菌Xenorhabdus 和Photorhabdus 分離出高活性的幾丁質酶，并對其進行酶活和抑菌實驗研究(Chen et al.，1996)，認為幾丁質酶普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌內，但有關共生菌幾丁質酶的作用機制研究報道卻并不多。

嗜線蟲致病桿菌X.nematophila HB310(Xn HB310)菌株是本實驗室從小卷蛾斯氏線蟲Steinernema carpocaposae HB310 中分離到的共生菌，對多種包括鱗翅目、鞘翅目在內的農林害蟲表現出很強的殺蟲活性(李秀花等，2003)，具有巨大的開發應用前景。王勤英等從Xn HB310 分離得到多種具有血腔注射活性和胃毒活性的殺蟲蛋白，并對這些蛋白的殺蟲機理進行了研究(王勤英等，2005;Wang et al.，2012)。本研究通過克隆和表達嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 幾丁質酶基因chi70，對蛋白Chi70 進行初步研究，為進一步研究Xn HB310 殺蟲機制和擴大應用范圍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和試蟲

嗜線蟲致病桿菌Xn HB310、pET-28a 為本實驗室保存，菌株Escherichia coli DH5α 和E.coli Transetta(DE3)購自于北京全式金公司，pMD18-T 購自于TAKARA 公司。棉鈴蟲Helicoverpa armigera 取自河北農業大學生物防治實驗室養蟲室。

1.2 主要試劑

PCR 相關試劑、Marker 等購自于北京全式金公司，限制性核酸內切酶購自于TAKARA 公司，DNA 膠回收試劑盒購自于上海生工。

1.3 培養基

LB 培養基:牛肉蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，定容1 L，pH7.2-7.4。

NBTA 培養基:營養瓊脂45 g，氯化三苯基四氮唑(TTC)0.025 g，溴百里酚藍(BTB)0.04 g，定容到1 L，pH7.2-7.4。

牛肉湯培養基:牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，定容1 L，pH7.2-7.4。

1.4 膠體幾丁質

2 g 粉末幾丁質加入40 mL 濃鹽酸，攪拌至完全溶解，800 mL 50%乙醇沉淀過夜，離心，用大量的去離子水洗滌致中性，最后定容到200 mL，制成1%膠體幾丁質。

1.5 細菌總DNA 的提取

將保存于NBTA 平板的Xn HB310 菌落接入到牛肉湯培養基中，180 rpm、28℃震蕩培養24 h，其菌液用于提取細胞總DNA，提取方法參照(Sanbrook et al.，2003)。

1.6 幾丁質酶基因chi70 克隆及原核表達體系的構建

根據NCBI 已知序列及功能預測分析設計基因chi70 克隆引物，上游引物 C70F:5'-ATGTCTCAAAATGTTTATCGATAC-3'，下游引物C70R:5'-CTACGATTTACGACGGGTTAC-3'。進行PCR 擴增，條件為:94℃預變性10 min;94℃30 s，56℃40 s，72℃1 min，30個循環;72℃延伸10 min。PCR 產物與pMD18-T 載體連接后，轉入E.coli DH5α。PCR 檢測正確后進行測序。根據測序結果，重新設計表達引物進行PCR，上游引物chi70F:5'-CGCGGATCCATGTCTCAAAATGT TTATCGATA-3'(BamHⅠ酶切位點)，下游引物chi70R:5'-CCCAAGCTTCTACGATTTACGACG GGTTAC(Hind Ⅲ酶切位點)。PCR 產物經BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切處理后插入到相同酶切處理的pET-28a 載體，轉入到DH5α，構建出表達載體pET-28a-chi70。通過測序對插入的chi70基因進行檢測。

1.7 幾丁質酶基因chi70 的分子生物信息學分析

利用 ExPASy Translate tool 在線程序和DNAMAN 等軟件對該基因進行分子生物學分析。

1.8 幾丁質酶的原核表達及誘導條件優化

將構建好的表達載體pET-28a-chi70 轉入到E.coli Transetta(DE3)中，轉化子經PCR 驗證后接入到5 mL 含有50 μg/mL 卡那霉素和氯霉素的LB 培養基中，37℃、180 rpm 培養過夜，次日按照1%接種量接入到200 mL 含有相同抗生素的LB培養基中，37℃、180 rpm 培養至OD600為0.5，加入100 mmol/L IPTG 繼續在37℃震蕩培養。通過設置不同誘導溫度對菌株進行誘導條件的優化。以相同處理的空載體轉化子E.coli Transetta(pET-28a)為對照。將誘導的菌液離心，10 mL PBS 懸浮，超聲破碎(工作2 s，間隔5 s，共15 min)，4℃、10000 rpm 離心15 min，上清經0.22 μm 細菌過濾器得到誘導表達的粗蛋白液，SDS-PAGE 電泳檢測，蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法(郭堯君，2001)。

1.9 幾丁質酶活性測定

采用二硝基水楊酸法(DNS 法)檢測幾丁質酶活性(李華等，2003)。設置不同pH 值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0)的緩沖液，求出反應體系中影響幾丁質酶活力的最適pH 值。

1.10 幾丁質酶增效作用的測定

將Bt HD-73 菌株懸液濃度設定為400、200、20、10、2 和1 μg/mL，分別與等體積的無菌水、含有0.3 g/mL 幾丁質酶粗提液加入到24 孔板中，每孔分別接入1 頭棉鈴蟲2 齡幼蟲。CK 組分別為滅菌水、Chi70 誘導菌液和Chi70 未誘導菌液的粗提液。每個處理48 頭試蟲，試蟲在26±1℃、相對濕度60%、光周期L∶D 為14∶10 條件下飼養72 h，計算LC50。計算方法參照張志祥(張志祥等，2002)。

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶基因的克隆和生物信息學分析

以chi70 全長引物從嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 總DNA 中PCR 擴增出了約1900 bp 條帶，測序結果表明chi70 全長基因為含有1947bp 的完整開放閱讀框，編碼648個氨基酸(見圖1)，推導的Chi70 蛋白理論分子量為72.4 kDa，等電點4.89，為酸性蛋白，GC 含量48.8%。將該基因序列提交GenBank 登記，登錄號為KC701471。

利用ExPASy ProtParam 在線工具對Chi70 蛋白進行分析，結果顯示，Chi70 由10017個原子組成，分子式為C3231H4903N869O998S16。Chi70 水溶液在280 nm 處的消光系數為118150，不穩定指數為38.06，半壽期大于10 h(參照大腸桿菌體內值)，由此可認為該蛋白在細菌胞內可穩定存在。Chi70的脂溶指數(aliphatic index)為71.10，疏水性平均值(GRAVY)為-0.553。利用Protscale 程序對Chi70 蛋白進行疏水性圖譜分析，其大部分氨基酸屬于親水性，由此表明該蛋白為水溶性蛋白。利用SignalP4.0 對Chi70 蛋白序列信號肽的預測結果顯示，Chi70 不含信號肽。

將Chi70 氨基酸序列與GenBank 中登錄的序列進行比對，從中選擇3個共生菌不同菌株幾丁質酶氨基酸序列進行同源性比較，結果見圖2。從圖中可以看出，Xn HB310 的Chi70 蛋白與不同屬的共生菌P.asymbiotica 幾丁質酶同源性并不高，這可能是由于它們的起源不同，但進化過程屬于趨同進化(Chaston et al.，2013);與同種的X.nematophila ATCC19061 的同源性很高;而同屬不同種的X.bovienii 的序列差異性也很高，說明幾丁質酶在進化上并不保守，正是因為這種變異，共生菌不同菌株在降解幾丁質活性上表現出明顯差異。

2.2 幾丁質酶的原核表達及重組蛋白SDS-PAGE分析

將重組表達載體pET-28a-chi70 轉入到Transetta(DE3)后，加入終濃度為1 μmol/L 的IPTG 在37℃進行誘導表達，SDS-PAGE 電泳檢測。結果表明，未誘導的菌株沒有表達目的蛋白，而誘導的菌株隨著誘導時間的延長，目的蛋白表達量增加，在80 kD 左右處可以看見明顯的誘導蛋白(見圖3)。Chi70 幾丁質酶蛋白理論值為72.4 kDa，帶有兩個HIS 標簽共6 kDa，共78 kDa，說明表達菌株正確地表達了目的蛋白。目的蛋白以包涵體的形式存在，通過改變誘導溫度使之大量表達出可溶性目的蛋白，當誘導溫度為28℃時，大量誘導出可溶性融合蛋白。

2.3 幾丁質酶酶活測定

以NAG 為反應底物，設置不同梯度濃度，測定OD540值，以確定NAG 濃度與吸光度之間的標準曲線。得到標準曲線公式為Y=9.8313X-0.0344(R2=0.9905)(其中Y 代表吸光度，X 代表底物濃度)。pH 值對Chi 酶活的影響見圖4，可以看出，重組Chi70 幾丁質酶活性在pH 值為7.0 時最高，為8.815 U/mL，表明該幾丁質酶在中性條件下具有相對較高的酶解活性。

2.4 幾丁質酶的增效作用

分別測定Bt HD-73 菌懸液和HD-73+Chi70混合物對棉鈴蟲二齡幼蟲的LC50。結果見表1。從表1 中可以看出，單獨用HD-73 飼喂棉鈴蟲時的致死中濃度LC50為14.80 μg/mL;與Chi70 幾丁質酶混合后飼喂棉鈴蟲幼蟲時的致死中濃度LC50則為5.66 μg/mL，后者顯著低于前者，即重組幾丁質酶Chi70 對Bt HD-73 具有增效作用。

圖1 chi70 基因推導的氨基酸序列Fig.1 Deduced amino acid sequence of gene chi70

圖2 Chi70 蛋白氨基酸與其他3種幾丁質酶序列同源比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequence of Chi70 with those of three other homologous species

圖3 chi70 基因表達產物SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed product of chi70 gene

圖4 Chi70 幾丁質酶在不同pH 值條件下酶活Fig.4 Chi70 chitinase enzyme activity at different pH value

表1 Chi70 幾丁質酶對Bt HD-73 增效作用Table 1 The synergistic activity of chitinase Chi70 to Bt HD-73

3 結論與討論

Morgan(2001)等發現，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilus PMFI296 毒素基因xptA1 上游有一個編碼幾丁質酶的基因序列，該基因同樣編碼648個氨基酸;推斷該幾丁質酶基因與其他毒素基因形成一個共同的致病基因簇，相互協同，共同對昆蟲產生致病作用，但具體分子致病機制還需進一步研究。Chen(1996)等針對5種嗜線蟲致病桿菌屬和發光桿菌屬線蟲共生菌幾丁質酶進行研究認為幾丁質酶普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌中，但活性存在明顯差異，幾丁質酶活性的差異與其來源的菌株及測定方法有一定關聯。

為了深入研究昆蟲病原線蟲共生菌中幾丁質酶的特性，本研究對嗜線蟲致病桿菌HB310 菌株中的幾丁質酶基因chi70 進行了克隆、表達和分子生物信息學分析，分析結果表明chi70 基因全長1947 bp，編碼648個氨基酸。生物信息學分析還發現Chi70 蛋白不含信號肽，但由于蛋白分泌機制具有多樣性，這并不能證明它就是一種胞內酶，還需要其他方法進行進一步研究證實。

昆蟲體壁、圍食膜對環境及外界生物的侵害起物理和化學屏障作用，而其中起主要作用的組分是幾丁質，幾丁質成為害蟲防治的突破點之一(Wiwat et al.，2000)。大量研究表明，幾丁質酶與Bt 制劑混合使用可以提高 Bt 殺蟲效果(Smirnoff，1971;Regev et al.，1996;Wiwat et al.，2000)。幾丁質酶的來源非常廣泛，Gopakakrishnan等(1995)把煙草天蛾幾丁質酶基因轉入到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV 中，并成功表達了該酶;王芳表達了桿狀病毒HaSNPV 幾丁質酶基因并研究了表達蛋白對Bt 的增效作用(2004);丁學知等將煙草幾丁質酶基因和蘇云金芽胞桿菌cry1Ac 進行了雙價基因的表達，這些研究都表明來源于不同物種的幾丁質酶都可以增強Bt 的殺蟲效果。本研究結果也顯示來自嗜線蟲致病桿菌HB310 菌株的幾丁質酶基因重組表達的Chi70 蛋白對Bt HD-73 具有明顯的增效作用。

嗜線蟲致病桿菌中的幾丁質酶在致病過程中起什么作用尚不清楚，Morgan 等認為，幾丁質酶基因與其他致病基因形成一個基因簇，多種表達產物共同作用造成昆蟲患病死亡。本研究對共生菌幾丁質酶基因進行分析，初步了解其理化性質;通過原核表達體系對幾丁質酶進行研究;并通過生測實驗確定其增效作，為進一步研究幾丁質酶Chi70 奠定基礎，為下一步深入了解共生菌的作用機制提供理論依據。

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