化瘀通絡方對局灶性腦缺血模型大鼠的保護作用

邱召娟，譚喜瑩，朱萱萱，朱吾元（.南京中醫藥大學附屬醫院，南京009；.南京中醫藥大學藥學院，南京 009）

化瘀通絡方主要由葛根、當歸、補骨脂、制大黃、水蛭等組成，具有活血化瘀、通絡調和的作用。臨床實踐表明，化瘀通絡方用于缺血性腦中風患者的治療療效確切[1]。藥理實驗證明，化瘀通絡方能抑制脂質過氧化反應，促進自由基清除，提高腦組織自身抗氧化能力[2-3]。筆者通過觀察化瘀通絡方在局灶性腦缺血模型大鼠中對一氧化氮合酶（NOS）mRNA和血管內皮生長因子（VEGF）mRNA表達的影響，從分子生物學角度研究化瘀通絡方對局灶性腦缺血模型大鼠內源性保護因子的作用，以探求該復方制劑防治急性缺血性卒中可能的作用靶點。

1 材料

1.1 儀器

Biophotometer蛋白核酸測定儀（美國Eppendorf公司）；Z366型臺式高速冷凍離心機（德國Hermle公司）；iCycler iQ system型實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；SDS-PAGE電泳及電轉印裝置（上海天能科技有限公司）；凝膠圖像分析系統（德國Pharmacia公司）。

1.2 藥品與試劑

化瘀通絡方（江陰天江藥業有限公司，批號：0910119，規格：10 g/袋）；腦血康膠囊（山東昊福制藥有限公司，批號：20100202，規格：0.15 g/粒）；青霉素（山東魯抗醫藥股份有限公司，批號：B091107，規格：80萬u）；戊巴比妥鈉（中國醫藥上海化學試劑公司，批號：F20091216）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、NOS測試盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol、SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain（美國 Invitrogen公司）；AMV反轉錄試劑盒（美國Promega公司）；引物（南京金斯瑞生物公司合成）；Taq PCR Master Mix Kit（德國Qiagen公司）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，♂，體質量280～320 g，由浙江大學實驗動物中心提供[實驗動物使用合格證號：SCXK（浙）2008-0033]。實驗大鼠均分籠飼養，飼喂全價顆粒飼料，自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度55%～65%，光照適度，通風潔凈。

2 方法

2.1 復制模型與分組、給藥

采用Longa法制備大鼠局灶性腦缺血模型。線栓保留2 h后，小心拔除到頸總動脈分叉處恢復血流。手術后給予青霉素抗炎。觀察模型大鼠清醒后的行為學改變，按Longa五級四分法評定動物神經功能，將第1、2、3級大鼠確定為成功模型。60只SD大鼠隨機均分為6組，即假手術（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、腦血康（0.9 g/kg）組與化瘀通絡方高、中、低劑量（16.0、8.0、4.0 g/kg）組。術前4 d開始ig給藥，每天1次，連續7 d。

2.2 大鼠腦組織總RNA的提取

取大鼠皮層組織約100 mg，稱質量，組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，加入Trizol。將懸液移入1.5 ml離心管中，按200 μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。然后于4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心15 min，取水相，加入0.5 ml異丙醇，混勻，室溫放置10 min。4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加75%乙醇（用DEPC水制備）1 ml洗滌沉淀；4℃下，以離心半徑為13.5 cm、12 000 r/min離心5 min，盡可能將乙醇吸凈，室溫下干燥5～10 min，用20 μl DEPC水溶解，－20 ℃貯藏，備用。

2.3 反轉錄

取1 μg總RNA按照Promega A3500反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄反應。反應體系為：5×AMV Buffer 4 μl、10 mmol/L dNTP 2 μ l、25 mmol/L MgCl24 μ l、RNAsin 1 μ l（10 u/μ l）、Random primer 1 μl（0.5 μg）、AMV反轉錄酶1 μl（10 u/μl），加無核酶水至20 μl。37 ℃反應60 min，94 ℃5 min 滅活，－20 ℃貯藏，備用。

2.4 RT-PCR檢測神經元型NOS（nNOS）、內皮型NOS（eNOS）、誘導型NOS（iNOS）與VEGF基因mRNA表達

引物用在線引物設計平臺Primer-Blast設計（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）。進行Realtime-PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統掃描分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

2.5 統計學方法

數據以±s表示，采用SPSS17.0軟件處理分析實驗數據。多組間單因素比較先用單因素分析其正態分布，后以LSD法進行統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織nNOS mRNA表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡方高、中、低劑量組大鼠腦組織nNOS mRNA表達無明顯改變（P＞0.05）。化瘀通絡方對模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達的影響見表2。

表2 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 2 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of nNOS mRNA in cerebral tissue of rat（s±s）

表2 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織nNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 2 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of nNOS mRNA in cerebral tissue of rat（s±s）

與假手術組比較：＊P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01

組別假手術組模型組腦血康組化瘀通絡方高劑量組化瘀通絡方中劑量組化瘀通絡方低劑量組nNOS mRNA 0.163±0.0210.504±0.069＊0.489±0.546 0.565±0.285 0.540±0.170 0.536±0.102 n 10 10 10 10 10 10

3.2 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織iNOS mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡方高、中、低劑量組大鼠腦組織iNOS mRNA表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。化瘀通絡方對模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達的影響見表3。

表3 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 3 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of iNOS mRNA in cerebral tissue of model rats （±s）

表3 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織iNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 3 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of iNOS mRNA in cerebral tissue of model rats （±s）

與假手術組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

?

3.3 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織eNOS mRNA表達無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，化瘀通絡方高、中、低劑量組大鼠腦組織eNOS mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）。化瘀通絡方對模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達的影響見表4。

3.4 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織VEGFmRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織VEGF mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡方高、中、低劑量組大鼠腦組織VEGF mRNA表達增強，差異有統計學意義（P＜0.01）。化瘀通絡方對模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達的影響見表5。

表4 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 4 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of eNOS mRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

表4 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織eNOS mRNA表達的影響（±s）Tab 4 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of eNOS mRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

與模型組比較：#P＜0.01 vs.model group：#P＜0.01

組別假手術組模型組腦血康組化瘀通絡方高劑量組化瘀通絡方中劑量組化瘀通絡方低劑量組eNOS mRNA 0.156±0.029 0.201±0.015 0.911±0.130＊0.323±0.033＊0.339±0.054＊1.497±0.135＊n 10 10 10 10 10 10

表5 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達的影響（±s）Tab 5 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of VEGFmRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

表5 化瘀通絡方對模型大鼠腦組織VEGF mRNA表達的影響（±s）Tab 5 Effects of Huayu tongluo fang on the expression of VEGFmRNA in cerebral tissue of model of model rats（±s）

與假手術組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.sham operation group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

假手術組模型組腦血康組化瘀通絡方高劑量組化瘀通絡方中劑量組化瘀通絡方低劑量組0.283±0.017 0.569±0.024＊0.556±0.0310.645±0.058#0.913±0.077#0.937±0.067#10 10 10 10 10 10

4 討論

研究表明，局灶性腦缺血早期NO增多，而早期NO的增加在病程中起到雙重作用，而這一作用與NOS的亞型相關[4]。NOS分為3種亞型：（1）nNOS，因其最早在神經元中發現而得名。它在生理狀態下有表達，病理狀態下可被誘導表達增高，是腦缺血早期神經元損傷的重要因素之一[5]。（2）eNOS，因其最早在內皮細胞中發現而得名。它的活性依賴于Ca2+濃度升高，eNOS活性對于維持腦血流有重要意義，是腦缺血后神經元的一個重要保護因子。一般在腦缺血后1 h活性增強，24 h達高峰[6]。（3）iNOS，其最早在巨噬細胞中被發現，活性不依賴于Ca2+濃度。它介導遲發性神經元損傷，是腦缺血晚期神經元損傷的重要因素之一。一般在腦缺血后12 h活性增強，48 h達高峰[7]。因此，選擇性地調控不同類型的NOS表達具有重要的臨床意義。本研究表明，化瘀通絡方雖然對局灶性腦缺血模型大鼠nNOS mRNA的表達沒有明顯影響，但是卻能通過抑制iNOS mRNA的表達在一定程度上降低NO相關的神經毒性；另一方面，化瘀通絡方能誘導eNOS mRNA表達增強，這對于舒張血管增加損傷區域的血流，發揮NO（eNOS源性）早期腦保護作用，有著重要的意義。

VEGF能特異性地直接作用于血管內皮細胞，是促進新生血管形成的重要細胞因子。Jin KL[8]等研究發現，VEGF mRNA表達提高可有效地促進新生血管形成、保護神經及促進缺血后神經元再生，這對減少腦損傷及恢復神經功能起到不容忽視的作用。本研究證明，化瘀通絡方對局灶性腦缺血模型大鼠腦組織的保護作用與其促進VEGF表達上調相關。

本研究證明，化瘀通絡方對局灶性腦缺血模型大鼠具有保護作用。一方面它能通過促進eNOS和VEGF的表達從而增加內源保護因子達到保護作用；另一方面通過減少iNOS的表達，減輕iNOS介導的遲發性神經元損傷而起到保護作用。通過研究還發現，低劑量化瘀通絡方對eNOS的影響明顯高于高、中劑量組，而對iNOS和VEGF的影響，低劑量組和中劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），但是均高于高劑量組。提示化瘀通絡方在后續研究和臨床使用中需要控制劑量，以達到更佳的療效。

[1]陳德芝，顧錫鎮，余江毅，等.腦血通顆粒聯合光氧合血液治療腦出血急性期60例：臨床與實驗研究[J].中國微循環，2004，8（5）：355.

[2]張忠華，朱萱萱，陳德芝，等.腦血通顆粒對腦缺血缺氧的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2003，14（12）：736.

[3]邱召娟，朱萱萱，達慶國，等.化瘀通絡方對局灶性腦缺血大鼠再灌注（MCAO）后腦組織氧自由基和NOS表達的影響[J].中華中醫藥學刊，2011，29（3）：509.

[4]Moro MA，Cárdenas A，Hurtado O，et al.Role of nitric oxide after brain ischaemia[J].Cell Calcium，2004，36（3/4）：265.

[5]Zhou L，Zhu DY.Neuronal nitric oxide synthase：structure，subcellular localization，regulation，and clinical implications[J].Nitric Oxide，2009 ，20（4）：223.

[6]Toda N，Ayajiki K，Okamura T.Cerebral blood flow regulation by nitric xxide：recent advances[J].Pharmacol Rev，2009，61（1）：62.

[7]del Zoppo G，Ginis I，Hallenbeck JM，et al.Inflammation and stroke：putative role for cytokines，adhesion molecules and iNOS in brain response to ischemia[J].Brain Pathol，2000，10（1）：95.

[8]Jin KL，Mao XO，Greenberg DA.Vascular endothelial growth factor：direct neuroprotective effect in vitro ischemia[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（18）：10 242.