左旋多巴聯合丹參注射液對魚藤酮致分化PC12細胞凋亡的影響Δ

謝利霞，趙飛宇，周 蓓，楊萬章（廣東醫學院附屬南山醫院藥劑科，廣東深圳 518052）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見中老年人的慢性進展性中樞神經系統疾病，其病變與患者黑質紋狀體多巴胺（DA）能神經元大量死亡，導致紋狀體缺乏大量DA有關[1]。左旋多巴為擬多巴胺類抗帕金森病藥，本身并無藥理活性，通過血腦屏障進入中樞，經多巴脫羧酶作用轉化成DA而發揮藥理作用，改善帕金森病癥狀。左旋多巴一直是治療帕金森病的最有效藥物，被譽為PD治療藥物的“金標準”。中藥丹參Salvia miltiorrhizabge.為唇形科鼠尾草屬植物，其根可入藥。其活性成分具有抗氧化作用，文獻報道丹參素對缺糖-缺氧損傷后神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞的凋亡過程具有抑制作用，對神經細胞具有保護作用[2]，同時也有研究表明丹酚酸B可抑制6羥基多巴胺（6-OHDA）導致的SH-SY5Y細胞凋亡[3]。

研究顯示，魚藤酮是繼1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）之后所發現的第二個導致多巴胺（DA）神經元退變的外源性化合物。因此，魚藤酮作為一種誘發PD的環境因素成為近來研究PD病因的熱點之一。褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤株（PC12）細胞因其在形態、生理、生化等功能特別是膜受體及遞質合成上與中腦DA能神經元十分接近而被視為體外替代DA能神經元較好的細胞模型[4-5]。因此，本研究選擇PC12細胞作為魚藤酮體外DA能神經元毒性作用的研究模型。

筆者以前的研究表明，魚藤酮可導致分化PC12細胞凋亡[6-7]。本研究通過水溶性四氮唑（WST-1）法和Hoechst 33342標記染色法同樣驗證了上述結果，并發現左旋多巴和丹參聯合作用可明顯提高分化PC12細胞增殖率。

上述研究提示左旋多巴與丹參在治療PD中具有潛在互補機制，聯合用藥的功效與機制有待進一步探討。本研究選用左旋多巴與丹參注射液聯用為研究對象，采用魚藤酮誘導PC12細胞凋亡作為PD體外模型，運用WST-1法檢測細胞相對增殖率，免疫印跡（ELISA）法檢測3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）蛋白含量與20S蛋白酶體（PSM）活性，進而研究左旋多巴聯合丹參注射液對魚藤酮誘導的分化PC12細胞的影響，探討其作用機制，為中西醫結合治療PD提供依據。

1 材料

1.1 儀器

DFM80C型熒光顯微鏡（上海蔡康光學儀器廠）；ELx800NB型多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司）；3K15型離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

丹參注射液（正大青春寶藥業有限公司，批號：1203301，規格：10 ml/支，每 1 ml含原兒茶醛不低于0.2 mg）；DMEM/F12培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；魚藤酮、碘化丙啶（PI）、神經生長因子（NGF）均購自美國Sigma公司；Hoechst 33432染色液（上海碧云天生物技術研究所）；WST-1試劑、左旋多巴（美國羅氏公司）；人3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，上海亞培生物科技有限公司）；人20S蛋白酶（20S PSM）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.3 細胞瘤株

PC12購自中國科學院上海生命科學研究院。

2 方法

2.1 細胞培養

DMEM培養基加體積分數為10%的胎牛血清（FBS）、青霉素1×105u/L、慶大霉素8×104u/L，5%CO2、37 ℃培養細胞。待細胞增長至90%融合時，用含0.1 g/L二胺二乙酸二鈉鹽的0.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，1∶5分瓶傳代，每4 d傳代1次，細胞每隔1 d換1次液。

2.2 復制模型與分組、給藥

魚藤酮（50 μmol/L）培養細胞24 h以復制PC12細胞凋亡模型。實驗分為7組，即正常對照（正常細胞，等容培養液）組、聯合用藥對照（正常細胞，左旋多巴2 μmol/L+丹參注射液3.125 μg/ml）組、模型（模型細胞，等容培養液）組、NGF（模型細胞，300 μg/L）組、左旋多巴（模型細胞，2 μmol/L）組、丹參注射液（模型細胞，3.125 μg/ml）組、聯合用藥（模型細胞，左旋多巴2 μmol/L+丹參注射液3.125 μg/ml）組。復制模型前6 h開始用藥培養細胞，連續6 h。

2.3 WST-1實驗

培養分化的PC12細胞，以每孔1×105細胞密度種于96孔板中，于培養箱中孵育24 h（在96孔板中長至大于90%），孵育細胞，加10 μl WST-1孵育1 h，在酶標儀450/690 nm雙波長處檢測光密度（OD）。實驗另設空白對照（無細胞，僅含培養液）和背景對照（含細胞，但不含WST-1，對照孔OD應小于011）。按標準計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）＝（實驗組均值/正常對照組均值）×100%。實驗結果為0級或1級反應是合格；實驗結果為2級反應的，應結合細胞形態分析，綜合評價；實驗結果為3～4級反應是不合格。細胞毒性分級為0～4級，其細胞相對增殖率由小到大分別為≥100%、75%～99%、50%～74%、25%～49%、0～24%。

2.4 Hoechst 33342核染色分析

將各組細胞棄除培養基，用質量分數為40 g/L多聚甲醛在室溫下固定30 min，棄固定液后PBS（pH7.2）洗3遍，10 mg/L Hoechst 33342室溫避光染色10 min，熒光顯微鏡下觀察染色質形態。

2.5 GAPDH蛋白含量的測定

收集各組細胞，提取總蛋白。將定量后的蛋白樣品（每孔20 μg）上樣于聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）小孔，100 V電泳1 h，300 mA下轉膜1.5 h。將轉好的硝酸纖維素膜用封閉液室溫振蕩封閉2 h，然后加入1∶500（V/V）GAPDH一抗，37 ℃孵育2h，TBS漂洗15 min×3次，再加入1∶2 000（V/V）辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗15 min×3次，增強化學發光劑顯影，膠片曝光。結果用UVP掃描儀掃描成像。

2.6 20S PSM表達的測定

各組藥物，棄除原培養液，用1×PBS清洗1次，在冰上操作，常規胰酶消化細胞，4℃下以離心半徑為5.0 cm、1000 r/min離心20 min，沉淀加入用蛋白提取液[10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），5 mmol/L 三磷酸腺苷（ATP），0.035%SDS，5 mmol/L MgCl2100 μl]超聲勻漿，采用BCA法測定蛋白含量，按試劑盒說明書將樣品稀釋成1 μg/μl，37 ℃下2.5 μl LLVY-AMC（5 mmol/L）避光反應1 h后，在連續波長掃描酶標儀上讀數。結果，激發波長為380 nm，發射波長為410 nm。以空白對照組與背景對照組為標準調零。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 聯合用藥對模型細胞增殖率的影響

與正常對照組比較，模型組細胞增殖率降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGF組、左旋多巴組、聯合用藥組細胞增殖率升高（P＜0.01或P＜0.05）。聯合用藥對模型細胞增殖率的影響見圖1。

圖1 聯合用藥對模型細胞增殖率的影響Fig 1 Effects of drug combination on the proliferation rate in model cells

3.2 聯合用藥對模型細胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色分化PC12細胞后，未呈現毒性，細胞無污染、過度死亡、衰老和分化等情況。細胞染色后，立即用倒置相差熒光顯微鏡觀察，在紫外光激發下，細胞核呈現藍色熒光。與正常對照組比較，模型組熒光強度增強；與模型組比較，聯合用藥組熒光強度減弱，且效果好于左旋多巴組。聯合用藥對模型細胞凋亡的影響見圖2。

3.3 聯合用藥對模型細胞GAPDH蛋白含量的影響

圖2 聯合用藥對模型細胞凋亡的影響Fig 2 Effects of drug combination on apoptosis in model cells

魚藤酮處理后細胞內GAPDH蛋白均隨時間的延長呈增加；而隨處理時間的延長，GAPDH的糖酵解酶活性反而下降；亞細胞組分的分離及ELISA進一步證實，魚藤酮處理后GAPDH主要在細胞核及線粒體組分內增多。根據各標準品質量濃度及其對應的OD，作標準曲線。通過標準曲線方程，根據測量的各組樣品的吸光度A450計算出各GAPDH質量濃度。結果顯示，50 μmol/L魚藤酮作用分化PC12細胞24 h，GAPDH蛋白含量明顯增加，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，聯合用藥組GAPDH蛋白含量減少，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05），且效果好于左旋多巴組。聯合用藥對模型細胞GAPDH蛋白含量的影響見表1[OD小于空白OD（0.0603）的樣品表示GAPDH質量濃度過低均按0 ng/ml處理]。

表1 聯合用藥對模型細胞GAPDH含量的影響（±s，n＝6）Tab 1 Effects of drug combination on the content of GAPDH in rotenone-induced differentiated PC12 cell（s±s，n＝6）

表1 聯合用藥對模型細胞GAPDH含量的影響（±s，n＝6）Tab 1 Effects of drug combination on the content of GAPDH in rotenone-induced differentiated PC12 cell（s±s，n＝6）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組NGF組左旋多巴組丹參注射液組聯合用藥對照組聯合用藥組GAPDH，ng/ml 0 5.48±0.13＊1.38±0.21##2.43±0.24#3.41±0.39 0 1.19±0.08##

3.4 聯合用藥對模型細胞20S PSM活性的影響

與正常對照組比較，模型組細胞內20S PSM活性減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，聯合用藥組細胞內20S PSM活性增強，差異有統計學意義（P＜0.01），且效果好于左旋多巴組。聯合用藥對模型細胞20S PSM活性的影響見表2。

表2 聯合用藥對模型細胞20S PSM活性的影響（±s，n＝6）Tab 2 Effects of drug combination on the activity of 20S PSM in model cell（s±s，n＝6）

表2 聯合用藥對模型細胞20S PSM活性的影響（±s，n＝6）Tab 2 Effects of drug combination on the activity of 20S PSM in model cell（s±s，n＝6）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組NGF組左旋多巴組丹參注射液組聯合用藥對照組聯合用藥組PSM，U/L 975.7±112.3 377.2±89.4＊797.2±103.1#696.2±104.8 577.2±98.1 953.4±121.6 882.2±134.8#

4 討論

本研究以魚藤酮作為誘導劑，通過WST-1細胞增殖率檢測法和Hoechst 33342標記染色法再次驗證上述結果，即魚藤酮可導致分化PC12細胞凋亡[6]。并發現左旋多巴和丹參聯合作用較左旋多巴或丹參單獨作用更能提高分化PC12細胞增殖率。

細胞、動物模型、流行病學研究以及臨床病例報道魚藤酮等是常見的與PD發病相關的神經毒素，在這些神經毒素誘導的神經元凋亡過程中均檢測到GAPDH基因過度表達、GAPDH酶蛋白異常聚集和核轉位，說明GAPDH基因過表達、GAPDH酶蛋白異常聚集和核轉位是PD發病機制中的重要環節[7-10]。眾所周知，PD典型的神經系統變性疾病，其病理性標志是路易小體（LB），它是一種嗜酸性蛋白包涵體，主要的蛋白成分包括α-synuclein、泛素、PSM亞單位、泛素羥基末端水酶（UCH-L1）、Parkin等，所以近來（UPS）在PD發病機制中的作用成為研究熱點[11]。有研究表明，PSM抑制劑Lactacystin在環境中廣泛存在，當易感人群通過生活接觸、飲食等方式將其攝入體內時，抑制了20S/26S PSM功能，致使UPS功能缺陷。在這種情況下，錯誤折疊、突變及損傷的蛋白質（主要包括α-synuclein）得不到有效降解而在細胞內堆積，會導致氧化應激水平的上升。當異常、突變、氧化修飾的蛋白超過了細胞的降解能力或者UPS本身功能受損都可以導致這些蛋白聚集，而聚集體內成分α-synuclein過度表達或突變也能削弱UPS的功能，UPS功能缺失致蛋白聚集，最終導致PD的發生[12]。文獻報道，20S PSM是診斷PD的潛在生物標記物之一，能為早期診斷PD提供一定幫助[13]。本實驗研究結果顯示，魚藤酮作用于分化PC12細胞，可顯著降低20S PSM含量，從而影響PSM功能。傳統化學藥左旋多巴可在一定程度上緩解魚藤酮所致的分化PC12細胞20S PSM活性減弱，但左旋多巴和丹參注射液的聯合應用可明顯增強PC12細胞20S PSM活性。

綜上所述，左旋多巴和丹參注射液聯合用藥通過降低細胞內GAPDH含量及增強20S PSM活性途徑拮抗魚藤酮誘導的分化PC12細胞凋亡，其效果優于左旋多巴單用，這一結果可為中西醫結合治療PD患者提供實驗和理論依據。

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