單羧酸轉運蛋白1、2在乳腺浸潤性導管癌中的表達變化及其與病理級別之間的關系

李 倩 何笑冬 舒小鐳 文 軍 李少林 (重慶醫科大學，重慶 0000)

乳腺癌是世界范圍內危害女性人群健康最常見的惡性腫瘤之一〔1，2〕。浸潤性導管癌(IDC)是一種最常見的乳腺癌，80%的乳腺癌都是IDC。單羧酸轉運蛋白家族(MCTs)是位于細胞膜上擔負乳酸等單羧酸及H+跨膜轉運的通道蛋白。除轉運單羧酸外，MTSs家族成員在催化糖酵解產物乳酸等單羧酸的轉運及細胞內pH值的調節方面發揮重要作用。迄今為止，對MCTs基因家族成員研究較為深入的是 MCT 1及 MCT 2。前者主要參與乳酸的跨膜轉運〔3〕，而后者則主要參與丙酮酸的跨膜轉運〔4〕。研究表明，實體腫瘤細胞以無氧糖酵解作為獲取能量的主要方式，這種代謝特點勢必導致腫瘤細胞內乳酸等大量酸性物質生成增多，引起細胞內環境的酸化〔5〕。資料顯示，MCT 1，MCT 2和MCT 4蛋白在乳腺癌、結腸癌、肺癌和卵巢腫瘤中均有高表達〔6〕，然而有關MCT 1、2在乳腺IDC的表達變化及其病理級別的關系卻鮮有報道。本研究擬觀察MCT 1和MCT 2在人不同級別乳腺IDC中的表達變化，探討乳腺IDC增殖、生長的分子機制。

1 材料和方法

1.1 病例及標本采集 隨機選擇2013年5～8月在重慶市腫瘤醫院住院手術治療的IDC患者37例。分為IDCⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級組;將癌旁相對正常組織為對照組。將收集到的乳腺癌Ⅰ～Ⅲ級的手術標本及癌旁正常組織部分進行石蠟包埋、切片，部分提取蛋白，置于-80℃冰箱備用。經過查詢患者病史及病理檢驗證實，所有患者術前均未接受免疫治療和放療、化療等。對照組的標本處理方法同前。

1.2 主要試劑 多克隆山羊抗人MCT 1、多克隆兔抗人MCT 2和單克隆小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，Santa Cruz公司);辣根酶標記的山羊抗兔IgG、辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記的鼠抗山羊IgG、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、二抗試劑盒(Dako公司)。

1.3 免疫組織化學顯色 將所取相對正常乳腺組織與各級乳腺IDC的組織常規固定后，按照程序進行石蠟包埋，連續切片，厚度為4 μm。常規脫蠟后行蘇木素-伊江(HE)染色，進行病理診斷和分級后，選片進行兩步法免疫組織化學顯色，MCT 1一抗濃度為1∶200，MCT2一抗濃度為1∶200，DAB 顯色，HE 復染細胞核，磷酸鹽緩沖液(PBS)終止顯色，脫水透明后封片，顯微鏡觀察并照相。陰性對照用0.01 mol/L的PBS代替一抗，其余步驟不變。采用北航(CM-2000B)生物醫學圖像分析系統進行圖像分析，測定免疫反應陽性細胞的積分光密度值。

1.4 Western印跡 用Western印跡和IP細胞裂解液(北京普利萊)提取對照組和各級乳腺浸潤性細胞瘤組織樣品總蛋白，十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠分離蛋白，通過濕轉方式將蛋白轉至硝酸纖維膜上，用Western印跡封閉液37℃封閉 1.5 h，分別加入 MCT 1(1 ∶300)、MCT 2(1 ∶300)、GAPDH(1∶500)一抗，4℃過夜孵育，PBS洗膜后分別加入相應二抗，37℃孵育2 h，PBS洗膜后DAB試劑盒顯色。用Quantity one軟件轉換后測定灰度值，以GAPDH為內參對照。

1.5 病理診斷 按照WHO乳腺腫瘤病理學和遺傳學分類(2003年)推薦應用經Elston和Ellis改良的Bloom-Richardson半定量組織學分級法進行乳腺IDC(非特殊性)的組織學分級。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0軟件，計量資料以s表示，多組均數進行比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 病理診斷 乳腺癌IDCⅠ級10例，Ⅱ級12例，Ⅲ級15例，見圖1。

2.2 MCT 1、2的免疫組織化學 對照組和乳腺癌浸潤性癌組織中均有MCT 1和MCT 2的表達。對照組中MCT 1和MCT 2在乳腺導管上皮細胞胞質內呈弱表達。而在浸潤性導管癌組織，MCT 1和MCT 2主要表達在腫瘤細胞的胞質和胞核中，并隨著腫瘤級別的升高，其表達量逐漸增強。圖像分析結果顯示，與對照組比較，MCT 1和MCT 2在乳腺癌浸潤性癌組織的表達明顯升高(P＜0.05);不僅如此，不同病理級別的乳腺IDC細胞中MCT 1和MCT 2的表達，也具有顯著性差異(P＜0.05)。從平均光密度值來看，MCT1和MCT2的表達模式具有一定的差異。見圖1，表1。

圖1 乳腺浸潤性導管癌病理分級和MCT1、MCT2在各腫瘤組及對照組中的表達(HE，×400)

表1 對照組和不同病理級別乳腺浸潤性導管癌組織中MCT1和MCT2的IOD值(s)

表1 對照組和不同病理級別乳腺浸潤性導管癌組織中MCT1和MCT2的IOD值(s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與各組間比較:2)P＜0.05

MCT1 MCT2對照組組別 n 37 6.11±0.12 3.27±0.17Ⅰ級組 10 23.32±0.331)2) 22.57±0.141)2)Ⅱ級組 12 46.91±0.111)2) 30.33±0.201)2)Ⅲ級組 15 67.49±0.231)2) 51.25±0.211)2)

2.3 MCT 1、2的Western印跡檢測 各腫瘤組織中均可見MCT 1和MCT 2條帶，與對照組相比，MCT 1和MCT 2在腫瘤組織中表達增強(P＜0.05)，并隨著腫瘤組織病理級別的升高，MCT 1、2表達增強(P＜0.05)，各腫瘤組織之間相比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 人不同級別乳腺浸潤性導管細胞瘤組織及對照組中MCT1、MCT2的蛋白表達

3 討論

乳腺癌是高度異質性的腫瘤，其中IDC占絕大多數 ，與其他類型乳腺癌相比較，其具有更加復雜的腫瘤細胞生物學行為。我國華東地區乳腺癌的發生率和病死率高于中西部地區;與西方發達國家相比較，中國患者發病年齡提前約10～15年，并可能伴有生物學標志物的改變〔2，7〕。腫瘤細胞生長在相對缺氧的環境中，其能量代謝的特點是有氧糖酵解。在酵解過程中，腫瘤細胞在獲取能量的同時，必將伴隨乳酸、丙酮酸等酸性產物的大量堆積，導致細胞內pH下降，引起腫瘤細胞內的酸化和凋亡。而腫瘤細胞內pH的降低，可抑制腫瘤細胞內原癌基因的激活，增強腫瘤對多種理化因素和化療藥物的易感性，從而誘導細胞凋亡〔8，9〕。然而，有資料顯示，腫瘤細胞內的pH值呈反向分布，即細胞內的pH值高于細胞外，相對于細胞外，細胞內更趨向于堿化〔10，11〕，而細胞內的堿化，與 MCTs表達異常有關。

MCTs是一類重要的跨膜轉運載體，涉及多種生物學功能。MCTs單羧酸轉運蛋白家族也叫SLC16基因家族，迄今已經發現了14種亞型，分別命名為MCT 1～9、MCT 11～14和T型氨基酸轉運蛋白-1(TAT-1)，而MCT 8則被認為是甲狀腺激素轉運體。由于MCTs家族成員可介導糖酵解產物乳酸等單羧酸及H+的跨膜轉運，因此MCTs對細胞內 pH值的調節方面發揮重要作用。資料顯示〔12〕，MCT 1，2可將腫瘤細胞內的乳酸和H+以1∶1的方式轉運到細胞外，升高細胞內的pH值，堿化細胞內環境，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞的增殖和生長。在MCT家族的研究中，MCT 1，MCT 2是發現最早的兩個亞型，因此對其的研究也相對較為深入。現已發現，MCT 1幾乎存在于所有的組織細胞中，而MCT 2僅在幾種組織中有表達，即使在與MCT 1一起表達的同一組織中其組織分布位置也與MCT 1不同，提示其可能有具有不同的功能。盡管目前對MCT 1，MCT 2在正常組織細胞中的分布與功能，特別是MCT 1的功能有了較深入的了解〔13，14〕，但對其在病理情況下，如缺氧、缺血、休克及腫瘤等病理性乳酸產生增高方面的相關研究報道卻并不多見。

本研究結果提示，乳腺IDC中MCT 1、2的高表達，有利于無氧糖酵所產生的酸性物質的跨膜轉運，減少其在細胞內的堆積，從而堿化乳腺癌細胞內環境，抑制乳腺癌細胞的凋亡，促進乳腺癌細胞的增殖和生長。因此，如能通過化療藥物或反義基因治療抑制MCT的表達，促使腫瘤細胞內環境過度酸化而死亡，將不失為一種治療乳腺癌的一條新思路。

1 Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012〔J〕.C A Cancer J Clin，2012;62(1):10-29.

2 鄭 瑩，吳春曉，吳 凡.中國女性乳腺癌死亡現況和發展趨勢〔J〕.中華預防醫學雜志 ，2011;45(2):150-4.

3 Jackson VN，Halestrap AP.The kinetics，substrate，and inhibitor specificity of the monocarboxylate(lactate)transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator，2c ，7-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein〔J〕.J Biol Chem，1996;271(2):861-8.

4 Lin RY ，Vera JC，Changanti RS，et al.Human monocarboxylate transporter 2(MCT 2)is a high affinity pyruvate transporter〔J〕.J Biol Chem，1998;273(44):28959-65.

5 Stubbs M，Rodrigues L，Howe FA ，et al.Metabolic conse-quences of a reversed pH gradient in rat tumors〔J〕.Cancer Res，1994;54(15):4011-6.

6 Pinheiro C，Reis RM，Ricardo S，et al.Expression of monocarboxylate transporters 1，2，and 4 in human tumours and their association with CD147 and CD44〔J〕.Biomed Biotechnol，2010;126(3):4107-57.

7 許 赪，王 寧，金冶寧，等.上海地區早發性乳腺癌臨床病理特征分析〔J〕.醫學研究雜志，2011;40(5):36-40.

8 Zheng CL，Che XF，Akiyama S，et al.2-Aminophenoxazine-3-one induces cellular apoptosis by causing rapid intracellular acidification and generating reactive Oxygen species in human lung adenocarcinoma cells〔J〕.Int J Oncol，2010;36(3):641-50.

9 Konstantinidis D，Koliakos G，Vafia K，et al.Inhibition of the Na+-H+exchanger isoform-1 and the extracellular signal regulated kinase induces apoptosis:a time course of events〔J〕.Cell Physiol Biochem，2006;18(4-5):211-2.

10 Dang CV，Semenza GL.Oncogenic alterations of metabolism〔J〕.Trends Biochem Sci，1999;24(2):68-72.

11 Helmlinger G，Sckell A，Dellian M，et al.Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(4):1284-91.

12 Kitano T，Nisimaru N，Shibata E，et al.Monocarboxylates and glucose utilization as energy substrates in rat brain slices under selective glialpoi soning-a31P NMR study〔J〕.Mol Cell Biochem，2003;244(1-2):77-81.

13 Merezhinskaya N，Fishbein WN ，Davis JI，et al.Mutations in MCT 1 cDNA in patients with symptomatic deficiency in lac-tate transport〔J〕.Muscle Nerve，2000;23(1):90-7.

14 Baker SK，McCullagh KJ，Bonen A.Training intensity-dependent and tissue specific increases in lactate uptake and MCT-1 in heart and muscle〔 J 〕.J Appl Physiol，1998;84(3):987-94.