桑葉多糖對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的影響

劉洪鳳 韓智學 聶 影 金龍云 王桂云 岳 輝 李 齊 薛繼婷 申梅淑

(牡丹江醫學院生物化學教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病腎病(DN)已成為導致慢性腎衰竭的首位病因，腎臟纖維化是各種原因腎臟疾病進展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎。在腎臟纖維化形成的發病機制中，細胞因子網絡始終是人們的研究熱點，組織轉化生長因子β1(TGF-β1)是目前公認的致纖維化最強的細胞因子〔1〕，針對TGF-β1的研究已成為治療DN的一個新的靶標。桑葉多糖(MLP)是桑葉的主要活性成分之一，具有降糖降脂、強心降壓、降低胰島素抵抗等多種藥理功效〔2～4〕。但是從分子水平研究MLP對DN大鼠TGF-β1基因表達的影響還未見有報道。本實驗探討MLP對DN大鼠的腎臟纖維化的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠100只，體重(220±50)g。MLP(南京澤朗醫藥科技有限公司);鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma公司);PCR引物(上海博亞生物技術有限公司合成)。

1.2 大鼠模型的制備及分組 清潔級Wistar大鼠隨機分為A組15只和造模組85只。造模方法:動物適應性喂養1 w后，禁食12 h，將STZ按65 mg/kg一次性(ip)給藥制備糖尿病大鼠模型。造模后每日檢測血糖、尿糖，連續3 d空腹血糖值 ＞16.7 mmol/L、尿糖定性?以上、尿量增加1倍以上為糖尿病模型形成。再繼續喂養1 w，隨機抽取兩只動物測尿 mAlb，mAlb＞15 μg/ml，確定DN模型形成。取造模成功的DN大鼠60只隨機分為 B組、C組、D組、E組，每組15只，余者棄掉。各組大鼠分別給以下處理:A組、B組大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射生理鹽水;C、D、E 治療組大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射 MLP(0.4、0.2、0.1 g/ml)，治療8 w后，取材后處死大鼠。

1.3 血、尿采集及生化檢測 MLP給藥治療8 w末，股動脈穿刺取血，血糖儀檢測空腹血糖(FPG)，兩點法測定尿素氮(BUN)，苦味酸法測定血肌酐(Cr)，以考馬斯亮藍法檢測微量白蛋白(mAlb)含量。

1.4 腎臟組織TGF-β1 mRNA水平檢測 取腎皮質100 mg，加液氮研碎后，采用Trizol試劑提取總RNA，兩步法RT-PCR反應檢測TGF-β1mRNA PCR，以 β-actin為內參照。反應條件為:94℃5 min 1 個循環，94℃ 變性 50 s，60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸45 s，35個循環后72℃延伸7 min。TGF-β1(405 bp)上游引物序列:5'-CGAGGTGACCTGGGCACCATCATGAC-3'，下游引物序列: 5'-CTGCTCCACCTTGGGCTTGCGACCCAC-3'; β-actin(240 bp)上游引物序列:5'-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游引物序列:5'-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3'。取PCR擴增產物5 μl在1.5%瓊脂糖中電泳，結果用UVPDGS-8000型凝膠成像系統成像，并用密度掃描儀分析PCR產物條帶，TGF-β1 mRNA表達水平以相對光密度表達量，即TGF-β1/β-actin 比率計算。1.5 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件，計量資料用s表示組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 大鼠FPG、BUN、Cr、mAlb變化 大鼠成模后出現代謝紊亂癥狀，并逐漸加重，體重下降。模型組FPG、BUN、Cr、mAlb高于A組(P＜0.01)。C、D 組 FPG、BUN、Cr、mAlb高于 B 組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

表1 各組大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

與A組比較:1)P＜0.01;與B組比較:2)P＜0.01

A組5.76±0.43 6.23±1.28 31.54±2.39 9.11±0.67 B組 23.96±0.321)6.31±1.311)65.68±11.851)85.57±2.941)C組12.75±0.511)2)6.26±1.231)2)42.24±15.971)2)30.51±2.731)2)D組16.95±0.581)2)6.28±1.211)2)50.32±14.721)2)59.43±3.521)2)E組20.29±0.371)2)6.29±1.251)2)63.87±13.361)2)71.68±5.661)2)

2.2 各組大鼠TGF-β mRNA表達的測定 C、D、E治療組腎臟TGF-β1mRNA 表達分別為(0.91±0.13)、(0.98 ±0.16)、(1.21±0.11)較 DN大鼠 B組表達顯著降低(1.23±0.09，P＜0.01)。B組腎臟 TGF-β1 mRNA較 A組明顯增高(0.89±0.12，P ＜0.01)。

3 討論

DN的主要病理變化特點包括腎小球肥大、腎小球細胞外基質(ECM)積聚、基底膜增厚以及腎小球纖維化，而ECM的過度積聚則是導致腎小球硬化發生和發展的基礎〔5，6〕。TGF-β1被認為是DN中導致ECM積聚的重要因子。高血糖能促進TGF-β1表達上調，而過度表達的 TGF-β1能刺激ECM合成;ECM的合成增加或降解減少，均可引起ECM過度積聚，而ECM的過度積聚最終會導致腎小球的纖維化。本實驗結果顯示MLP可以顯著降低DN大鼠的FPG，BUN、Cr及mAlb水平，說明MLP對DN大鼠腎臟有著良好的保護作用，其作用機制可能與MLP下調TGF-β1 mRNA表達有關。本研究結果為今后運用MLP治療DN提供了實驗依據，也為臨床干預DN進展提供新的靶標。

1 Wu Y，Ren K，Liang C，et al.Renoprotective effect of total glucosides ofpaeony(TGP)and its mechanism in experimental diabetes〔J〕.J Pharmacol Sci，2009;109(1):78-87.

2 劉洪鳳，任巖海，韓智學，等.桑葉多糖對糖尿病大鼠resistin mRNA表達的影響〔J〕·中國食物與營養，2012;18(4):67-8.

3 任巖海，劉洪鳳，韓智學.桑葉多糖對2型糖尿病大鼠血糖血脂的影響〔J〕.中醫藥學報，2013;41(1):20-1.

4 任巖海，劉洪鳳，宋鐵軍，等.2桑葉多糖對糖尿病大鼠 Resistin蛋白表達的影響〔J〕.中醫 藥信息，2012;29(6)22-3.

5 孫培榮，石永兵，施曉松.銀杏達莫對梗阻性腎病大鼠腎間質纖維化中 TGF-β1表達的影響〔J〕.中國誤診學雜志，2010;26(9):6304-6.

6 Wang W，Huang XR，Canlas E，et al.Essential role of Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced vascular fibrosis〔J〕.Circ Res，2009;98(8):1032-9.