兩種熱量限制方式對SH-SY5Y細胞氧化損傷作用的比較

陳 娟 張景燕 王 蓉 趙靜姝 郭 瑾 王玉蘭 張 旭

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室 北京老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室，北京100053)

熱量限制(CR)是指有計劃的減少由食物提供的熱量，一般是在保證足夠的維生素和礦物質水平下，將正常自由進食所得的熱量減去30% ～50%〔1〕。老年癡呆成為威脅人類健康的主要疾病之一。研究表明，CR具有提高認知及記憶能力、延緩退行性疾病的發生及發展、延緩衰老等有利作用，其中，抗氧化應激損傷是作用機制之一〔2〕。目前，用于體內研究的CR方法有很多，如減少食物中脂類、糖類物質的比例，也有用藥物干預如白藜蘆醇等〔3〕。本實驗旨在通過降低培養液中細胞的主要能量消耗來源葡萄糖的方式和白藜蘆醇模擬CR作用，建立SH-SY5Y細胞CR模型，對比兩種方法對 H2O2誘導的 SHSY5Y細胞損傷的保護效果。

1 材料和方法

1.1 材料 人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞來自瑞典卡羅林斯卡醫學院。噻唑藍(MTT)購自Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京化工廠，編號001012，30%H2O2購自北京化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 細胞用DMEM×F12(Gibco)培養基培養(3.0 g/L-葡萄糖)，加入10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 IU/ml于37℃，5%CO2培養箱中培養。貼壁細胞生長密度達到70% ～80%時，分組處理:對照組及損傷組，DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清，培養24 h;低糖組及低糖+損傷組，換用低糖組培養基為DMEM(2.0 g/L-葡萄糖)加1%胎牛血清，培養24 h;白藜蘆醇組和白藜蘆醇+損傷組，換用DMEM×F12(3.0 g/L-葡萄糖)加入1%胎牛血清及不同濃度的白藜蘆醇，培養24 h;預處理后予以250 μmol/L的H2O2分別損傷1 h和7 h。用于后續實驗。

1.2.2 MTT代謝率測定 將SH-SY5Y細胞接種于96孔板中，細胞接種密度1.0×104/孔，待細胞貼壁生長至70% ～80%時予以相應處理，加入MTT溶液(5.0 g/L)20 μl繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加入150 μl DMSO作用10 min后，用全波長酶標儀(Multiskan Spectrum)測定570 nm處光密度值。

1.2.3 細胞形態觀察 將SH-SY5Y細胞以2×102/ml接種于6孔板(Costar產品)中，分為對照組(3.0 g/L-葡萄糖)、損傷組(250 μmol/L H2O2)、低糖組(2.0 g/L-葡萄糖)、低糖+損傷組、白藜蘆醇(1.25、5 μmol/L)組、白藜蘆醇(1.25 μmol/L)+損傷組，處理方式同前，用倒置顯微鏡(Olympus產品)觀察細胞形態的改變。

1.2.4 LDH漏出率測定 細胞培養方法同前，按照比色法，測定570 nm處光密度值，同時做表。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.5軟件統計進行方差分析。

2 結果

2.1 MTT代謝率測定 對照組細胞活力為(0.762±0.016)，用低糖和白藜蘆醇預處理細胞24 h，低糖組細胞活力上升(0.847±0.013，P ＜0.01);白藜蘆醇1.25 μmol/L 組活力稍上升，但無統計學差異(0.768±0.016，P＞0.05);白藜蘆醇5 μmol/L組活力下降(0.685 ±0.019)。用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h，低糖+損傷組在1 h和7 h活力都上升;而白藜蘆醇+損傷組在損傷1 h時活力上升，但是在作用7 h后活力明顯下降。見表1。

2.2 LDH漏出率測定結果 損傷1 h后結果顯示，與對照組相比，損傷組漏出率明顯增加(1.368±0.101 vs 1.249±0.079，P＜0.05)，低糖組、白藜蘆醇組漏出率稍有減少，但無統計學差異(1.163±0.052，1.198±0.071，P ＞0.05);與損傷組比較，低糖+損傷組漏出率明顯減少(1.143±0.047，P＜0.01)，白藜蘆醇+損傷組漏出率減少(1.251±0.067，P＜0.05)。繼續培養至7 h顯示，低糖組漏出率由增加至(1.223±0.107)，增加了5%;低糖+損傷組漏出率增加至(1.262±0.081)，增加了11%;白藜蘆醇+損傷組由顯著增加至(1.863±0.165)，增加了48%(P＜0.01);白藜蘆醇+損傷組漏出率高于低糖+損傷組(P＜0.01)。

2.3 細胞形態學觀察 未加損傷之前，低糖組細胞形態，與空白組比較無明顯改變，加入損傷藥物1 h后，各組細胞形態與空白組比較無明顯改變，加入7 h后，低糖組、低糖組+損傷組和空白組。細胞突起伸展良好細長，白藜蘆醇+損傷組可見細胞數目明顯減少，死細胞多，細胞突起回縮，細胞明顯變圓，貼壁性不好，透光性差。見圖1。

表1 用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h各組細胞活力(s)

表1 用250 μmol/L H2O2分別處理1 h和7 h各組細胞活力(s)

與對照組及損傷組比較:1)P＜0.01

0.302 2±0.001 0.537 2±0.007損傷組 0.204 8±0.003 0.147 7±0.001低糖組 0.446 4±0.0081) 0.582 7±0.0061)低糖+損傷組 0.448 4±0.0061) 0.568 8±0.0031)白藜蘆醇+損傷組 0.208 9±0.0061) 0.156 2±0.0021)1 h 7 h對照組分組

圖1 各組細胞形態(×3 000)

3 討論

與疾病有關的危險因子，如高熱量飲食、維生素缺乏(如葉酸和抗氧化劑)等，也與阿爾茨海默病、帕金森綜合征等神經退行性疾病密切相關〔4〕。CR抗氧化應激損傷延緩衰老的可能機制之一是通過SIRT1介導的〔5〕。而白藜蘆醇作為SIRT1的激動劑，用于模擬CR模型的體外研究也很多。SH-SY5Y細胞來源于神經母細胞瘤，其細胞形態及生理，生化功能與正常神經元相似，已經廣泛用于神經生物學研究〔6〕。

本實驗發現，白藜蘆醇只對急性期的氧化應激損傷起保護作用，對于長期的氧化應激損傷，白藜蘆醇顯示一定的毒性反應。這一結論提示在CR或氧化逆境條件下，可能增加了細胞內的SIRT1蛋白的表達，通過抑制PPAR2r減少細胞的脂質過氧化的損傷〔7〕;調控 P53 的活性影響細胞的壽命〔8〕;調控FOXO的信號通路，啟動細胞的抗氧化途徑〔9，10〕。近年對白藜蘆醇的研究顯示，白藜蘆醇在心腦血管疾病、內分泌疾病、腫瘤等方面都發揮了很好的作用，也有人把它作為CR的代用品，然而，目前對白藜蘆醇在使用上也存在些問題，如:治療劑量還很不一致，使用大劑量白藜蘆醇顯示一定的毒性反應〔10〕，與本實驗中的觀察結果一致，而且白藜蘆醇吸收入血后的半衰期短，不便于臨床的使用。因此，低糖處理更能模擬CR的體外模型。

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7 Yi H，Liu J，Wang JF，et al.The controversial links among calorie restriction，SIRT1，and resveratrol〔J〕.Free Radical Bio Med，2011;51(2):250-6.

8 Mikael Molin，Yang JH，Sarah Hanzen，et al.Life span extension and H2O2resistance elicited by caloric restriction require the peroxiredoxin Tsa1 in Saccharomyces cerevisiae〔J〕.Mol Cell，2011;43(5):823-33.

9 Zhang F，Wang SP，Gan L，et al.Protective effects and mechanisms of sirtuins in the nervous system〔J〕.Prog Neurobiol，2011;95(3):373-95.

10 郭燕世.熱量限制與白藜蘆醇抗衰老的研究進展〔J〕.生理科學進展，2011;42(3):161-4.