復元膠囊對膝骨關節炎大鼠IL-1β、OPG和OPGL mRNA表達的影響

李 強 周國慶 鄧紫婷 李榮亨 (重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶 400016)

骨保護素(OPG)/骨保護素配體(OPGL)的比值在破骨細胞的分化成熟中起到重要作用，參與調控軟骨下骨的骨重塑過程。近期發現，在關節軟骨中有OPGL與OPG的表達〔1〕，并從軟骨細胞彌散到軟骨下骨，與OA的形成及關節旁骨丟失相關聯。白細胞介素(IL)-1可以通過影響RANKL-RANK相互作用機制調節破骨細胞的分化和功能。復元膠囊是經過長期臨床驗證，對骨關節炎(OA)有顯著療效的復方制劑，本實驗通過Hulth法建立實驗性OA大鼠模型，用復元膠囊進行治療，與臨床上常用于治療OA的中成藥抗骨增生膠囊對照，通過檢測關節軟骨中IL-1β、OPG和OPGL mRNA表達變化，探討復元膠囊是否通過調節OPG與OPGL的平衡、降低IL-1的表達而達到緩解OA的損傷作用機制，并深入了解IL-1β與OPG和OPGL在OA中的相互作用關系。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物:健康成年雄性SD大鼠60只(重慶醫科大學動物實驗中心提供)，體重200～250 g。實驗動物生產許可證號:SYXK(渝)2012-0001。②實驗藥物:復元膠囊(批準文號:渝衛2002〔42-33〕)由淫羊藿、鹿茸、黃芪、人參、枸杞子、川芎等組成，每粒膠囊重0.41 g相當于生藥4.0 g，由重慶希爾安藥業有限責任公司生產。抗骨增生膠囊，由江蘇康緣藥業股份有限公司生產，生產批號:110402。

1.2 方法 ①動物分組:60只雄性SD大鼠隨機分為6組:正常組、模型組、抗骨增生膠囊組、復元膠囊高、中、低組，每組10只。②建立動物模型:隨機選擇50只大鼠，依照Hulth法造模〔2〕，0.035 g/kg水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下沿右側膝關節內側切開長約2 cm切口，暴露膝關節，切斷前后交叉韌帶及內側副韌帶，完整切除內側半月板，逐層縫合關節腔，無菌包扎。術后每天肌注青霉素2×104U/kg，共1 w，余下10只作為正常組，1 w后，每天驅趕大鼠跑步30 min。③給藥:根據Meeh-Rubner公式計算大鼠的給藥劑量。手術后第2周復元膠囊組分別給予復元膠囊 2 229.90、743.30、371.65 mg·kg－1·d－1，抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊 557.00 mg·kg－1·d－1，分別配置成3 ml溶液灌胃。模型組給予每天等量生理鹽水灌胃，正常組不予任何處理。連續12 w。

1.3 標本處理 按期處死大鼠，取大鼠右側膝關節關節軟骨及軟骨下骨標本，置于4%多聚甲醛中固定，10%EDTA中脫鈣，矢狀位取材，常規脫水石蠟包埋，切片備用。

1.4 觀察指標 ①大體觀察關節軟骨:在灌胃12 w時，處死各組大鼠，觀察有無關節積液及滑膜腫脹，并于光學顯微鏡下觀察膝關節軟骨的情況，按Pelletier-JP標準進行評分。評分標準:0分:關節面透明光整，色澤正常;1分:關節面粗糙，有裂隙，色澤灰暗;2分:關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表層和中層;3分:關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層;4分:軟骨剝脫，軟骨下骨暴露。②光鏡觀察軟骨細胞及基質:切片進行HE染色，顯微鏡下觀察關節軟骨的結構、細胞數量及潮線的完整性。參照Mankin等〔3〕法的關節軟骨病理評分標準進行積分統計。③RT-PCR法檢測軟骨中 IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表達:取損傷區關節軟骨在液氮中研磨成粉末，按照說明書操作提取總RNA，紫外分光光度儀檢測樣品吸光度(A)，A260/280在1.8～2.0之間。應用RT-PCR法檢測標本中IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表達。其中 IL-1β引物序列:①上游:5'TCTGTGACTCGTGGGATGAT3';②下游:5'CTTCTTTGGGTATTGTTTGG 3';反應條件:變性94℃ 30 s，退火55.4℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環，72℃延伸5 min。OPG引物序列:①上游:5'TGCTCCTGGCACCTACCTAA 3';② 下 游:5'TCACCTGAGAAGAACCCATCC 3';反應條件:變性 94℃ 30 s，退火58.7℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共 30 個循環，72℃ 延伸 5 min。OPGL引物序列:①上游:5'TACAGGTTTGCAGGACTCGAC 3';②下游:5'AGGACAGACTGACTTTATGGGAA 3';反應條件:變性94℃ 30 s，退火57.6℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環，72℃延伸5 min。GAPDH引物序列:①上游:5'GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3';②下游:5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT 3';反應條件:變性 94℃ 30 s，退火 58.5℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，共30個循環，72℃延伸5 min。反應產物用3%瓊脂糖凝膠電泳(80 mV，30 min)，采用凝膠成像系統掃描和分析擴增帶，與內參GAPDH比較，得到相對表達強度。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.0軟件，計量資料以s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和兩兩比較(LSD法)，等級資料采用多組單向有序資料的Ridit分析，計算合并方差，并進行統計學兩兩檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 造模過程動物無死亡，術后無感染，健康狀況良好，術后模型組及治療組，局部刺激有疼痛反應，患肢收縮痙攣，后肢跛行明顯，蹬地力量減弱，伴有關節不穩，有異常活動度，1 w后消失，4 w后關節畸形腫大，正常組關節外部結構正常，無腫脹，活動自如。

2.2 大體形態觀察 正常組關節面平整光滑、呈淡藍色、色澤明亮、無裂紋及軟化、滑膜無增生、關節液清涼透明。模型組病理改變明顯，軟骨面糜爛、顏色灰暗、失去光澤、軟骨邊緣增生明顯、多數標本可見大小不等的潰瘍、并深達骨質、軟骨下骨暴露，滑膜不同程度增生粘連、關節液增多、混濁。復元膠囊高、中劑量組及抗骨增生組軟骨面稍粗糙、顏色淡黃、軟骨邊緣有增生、部分有裂紋及小潰瘍出現、滑膜可見少許增生、關節液略增多。各組膝關節軟骨退化評分見表1。

2.3 光鏡觀察 正常組關節軟骨四層結構清楚、軟骨表層光滑平整、各層細胞排列整齊、潮線清晰;模型組軟骨層變薄、表層有裂隙、細胞數目變少紊亂、潮線嚴重斷裂模糊;抗骨增生組軟骨表面欠平整、細胞層數增多、排列稍紊亂、潮線斷裂呈雙層;復元低劑量組表層裂隙形成、細胞排列紊亂、陷窩出現空泡樣變、潮線紊亂;復元中劑量組、細胞層增生、細胞數目增多;復元高劑量組表層平整、細胞略有增生、中層有少量細胞簇聚、可見雙重潮線。見圖1，Mankin評分見表2。

表1 各組膝關節軟骨退變程度分級(n，n=10)

圖1 各組關節軟骨光鏡觀察結果(HE，×200)

2.4 關節軟骨中IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表達結果 與正常組相比，模型組軟骨細胞中IL-1β、OPG和OPGL mRNA的表達含量均顯著增高(P＜0.01)，復元膠囊治療組及抗骨增生膠囊治療組 OPG mRNA表達含量明顯增高(P＜0.05)，IL-1β mRNA、OPGL mRNA的表達含量明顯降低(P＜0.05)，OPG與OPGL的比值在復元膠囊高劑量組與中劑量組中增高(P＜0.05)。見表2，圖2。

表2 各組大鼠膝關節軟骨中Mankin評分、IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表達及OPG/OPGL比值變化( s，n=10)

表2 各組大鼠膝關節軟骨中Mankin評分、IL-1β、OPG、OPGL mRNA的表達及OPG/OPGL比值變化( s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.05

OPG OPGL OPG/OPGL復元高劑量組 4.8±0.631)3) 0.52±0.062)3) 1.15±0.121)3) 1.06±0.193) 1.12±0.311)3)組別 Mankin評分 IL-1β 4±0.18復元中劑量組 5.70±0.951)3) 0.83±0.121)3) 1.20±0.031)3) 1.33±0.47 0.97±0.301)3)復元低劑量組 7.9±0.991)4) 0.89±0.141)3) 0.79±0.091)3) 1.59±0.592) 0.55±0.20抗骨增生組 5.9±0.741)3) 0.82±0.111)3) 1.06±0.051)3) 1.23±0.324) 0.51±0.28模型組 8.80±0.631) 1.27±0.081) 0.58±0.051) 1.75±0.371) 0.34±0.11正常組 0.50±0.53 0.42±0.07 0.46±0.04 1.05±0.26 0.4

圖2 各組大鼠關節軟骨組織IL-1β、OPG、OPGL mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

OA發病機制與軟骨細胞退變，軟骨下骨重塑等有重要關系。OPG/OPGL/RANK系統是聯系軟骨與軟骨下骨的一條關鍵路徑，OPG與OPGL的平衡對軟骨下骨的重塑起到決定性的作用。OPG與OPGL均可由軟骨細胞分泌，當膜分泌蛋白型OPGL與破骨細胞前體表面的RANK結合后，介導破骨細胞前體轉換成成熟的破骨細胞，破骨細胞的活化促進骨的重吸收，而OPG可競爭性結合OPGL，抑制骨的重吸收。已經證明體內多種作用于破骨細胞的細胞因子都是通過改變OPG/OPGL的比率實現的〔4〕。

IL-1β是OA中一個關鍵性的炎癥因子，可以通過多條路徑誘導關節軟骨細胞過早衰老〔5〕，提示IL-1β的升高程度與軟骨的損傷程度呈正相關。Watanabe等〔6〕通過研究顯示，IL-1β可以通過增加軟骨細胞中OPG的表達含量抑制破骨細胞的生成。

本實驗通過Hulth法建立實驗動物模型，造模后1 w驅趕大鼠每天跑步30 min，在12 w時相當于OA的晚期〔7〕。關節大體及光鏡評分中模型組比正常組顯著增高，說明病變嚴重程度與積分高低呈正比，也提示本實驗造模成功。模型組中RTPCR結果顯示，OPG mRNA、IL-1β mRNA和OPGL mRNA的表達含量均顯著增高，與Pilichou等〔8〕研究一致，OPG含量與OA嚴重程度成正比，這可能是軟骨細胞受損做出的自我保護反應，也可以用Watanabe等〔6〕的研究結果解釋，這與IL-1β的升高，刺激軟骨細胞分泌OPG，抑制成熟破骨細胞的形成相關。本研究結果說明復元膠囊可以上調軟骨組織中OPG mRNA的表達含量，下調IL-1β mRNA和OPGL mRNA的表達含量，阻止破骨細胞的成熟，抑制軟骨下骨重吸收，防止骨侵蝕加重。

OA屬于中醫的痹證范疇，中醫素有腎主骨的說法，《素問·痹論》中有“風寒濕三氣雜至，合而為痹...故骨痹不已，復感于邪，內舍與腎。筋痹不已，復感于邪，內舍與肝”的說法，故痹證日久不愈，氣血運行不暢，瘀血阻閉經絡，正氣耗傷，累及肝腎，因而此病具有“久病必虛，久病多瘀，久病累及肝腎”的病變特點，屬于以肝腎虧虛為本，瘀血閉阻經絡為實的本虛標實的證候，故應用補肝腎同時輔以活血化瘀的方法進行治療。復元膠囊是由臨床驗方復原湯化裁而來，由淫羊藿、鹿茸、黃芪、人參、枸杞子、川芎等組成。本方具有補肝腎，滋養、濡潤筋骨，使其“榮則不痛”。同時本方還具有活血化瘀，疏通經絡，使其“通則不痛”，達到標本兼治的目的。而現代藥理研究證明，補腎的中藥及其中的單體成分如淫羊藿總黃酮、川芎嗪等能夠調節OPG/OPGL的比值保護骨組織〔9～11〕，而一些益氣活血的中藥及單體能夠抑制IL-1β的表達〔12，13〕。復元膠囊在保護骨組織的同時能下調炎癥因子的表達，無疑對骨關節炎的治療帶來了新的思路。

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