白細胞介素18在非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用機制

李愛連 胡志芳 史宏恩 (西安醫(yī)學院病原生物與免疫學教研室，陜西 西安 710021)

白細胞介素(IL)-18是一種常見的前炎癥因子，在感染、癌癥等各種疾病中發(fā)揮著重要作用〔1〕。IL-18通過增強自然殺傷細胞(NK)與T淋巴細胞的細胞毒性作用與增強干擾素(IFN)活性等作用發(fā)揮抗感染、抗腫瘤與增強免疫能力等生物學活性，且與自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)〔2〕。本文擬分析IL-18在非小細胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC高、低轉(zhuǎn)移細胞由本科室常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試驗儀器與試劑 DNA序列(上海博亞公司合成)，RNA提取、PCR擴增、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pGEM-T載體、內(nèi)切酶、連接酶均從Santa Cruz公司購入，RIPA緩沖液、Anti-IL-18小鼠單抗，Anti-actin小鼠多抗，顯色試劑盒從Promega公司購入，G418、陽離子脂質(zhì)體從Invitrogen公司購入。

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-PCR 提取NSCLC細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，使用β2-微球蛋白(β2-BMG)作為內(nèi)參照，并按照PCR擴增試劑盒說明說進行PCR擴增，條件:變性94℃、30 s，退火 72℃、30 s，延伸 30 s，周期:28 個循環(huán)，最后一個周期延伸(72℃、7 min)，引物序列①IL-18:(正)5'-GCCGGTACCCGCATGGGTGGTGAACGACTAGAA-3';(反)5'-GCGTCTAGAGTCTTCGTTTTGAAACAGTGAA-3';②β2-BMG:(正)5'-GCTATCGGAAGAGCAGCGTACTCCAAAGA-3'(反)5'-AACCTGCTCSGATACATCAAACAT-3'。

1.3.2 Western印跡技術(shù) 采用RIPA緩沖液提取細胞總蛋白，采用β-actin作為試驗組的內(nèi)參對照，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 構(gòu)建IL-18重組顆粒與細胞體外轉(zhuǎn)移實驗 在RT-PCR實驗中，從NSCLC細胞株中擴增IL-18 cDNA，連接pGEM-T載體，內(nèi)切酶鑒定并進行測序，成功構(gòu)建IL-18重組顆粒。采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將IL-18真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞株中，加入800 μg/μL的G418加壓獲取穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞。細胞體外轉(zhuǎn)移實驗:將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞接種于培養(yǎng)液中，加入培養(yǎng)基，在血清條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:50 mg/L CO2、37℃中處理8 h，無水乙醇固定，高倍顯微鏡下檢查視野中的穿膜細胞，重復(fù)進行3次實驗，取平均值進。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 IL-18在NSCLC高、低轉(zhuǎn)移中的蛋白與 mRNA表達Western印跡檢測結(jié)果表明:低轉(zhuǎn)移細胞株未檢測到IL-18蛋白表達，高轉(zhuǎn)移的NSCLC細胞株的IL-18蛋白表達量高達3.98±2.01，兩者比較差異顯著(t=6.17，P＜0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測IL-18蛋白表達

半定量RT-PCR顯示:低轉(zhuǎn)移細胞株未檢測到IL-18 mRNA的表達，高轉(zhuǎn)移的NSCLC細胞株的IL-18 mRNA表達水平高達5.41±1.20，兩者比較差異顯著(t=8.09，P＜0.05)。見圖2。

圖2 半定量RT-PCR檢測IL-18 mRNA表達

2.2 IL-18基因?qū)氚┑娃D(zhuǎn)移株后對轉(zhuǎn)染細胞體外遷移的影響 導(dǎo)入IL-18基因的NSCLC低轉(zhuǎn)移株的轉(zhuǎn)移能力為空白對照細胞株的3倍左右，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.34，P ＜0.05)。

3 討論

IL-18 具有誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-12、IFN-γ等細胞因子合成，誘導(dǎo)Th1輔助細胞分化，增強NK細胞的細胞免疫功能等作用〔3〕。

IL-18在NSCLC病情發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。腫瘤轉(zhuǎn)移程度是由腫瘤組織轉(zhuǎn)移能力與免疫抑制腫瘤相互作用的結(jié)果決定的，研究〔4〕發(fā)現(xiàn):IL-18具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫及血管生成的作用，能抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展及促進腫瘤相關(guān)重要因子的合成。IL-18通過免疫激活作用實現(xiàn)抑制腫瘤發(fā)展的作用，表現(xiàn)在直接或間接啟動IFN-γ的活性、加強T細胞的增殖能力〔5〕。IL-18促進NK細胞的毒性效應(yīng)，在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移鼠模型中，脾內(nèi)注射IL-18后，血清中的一氧化碳(CO)水平顯著升高，巨噬細胞毒性增強，提示IL-18可顯著增強細胞毒性作用〔6〕。有研究〔7〕證實了轉(zhuǎn)染IL-18穩(wěn)定性骨髓基質(zhì)干細胞株對腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有明顯的抑制作用。楊文剛等〔8〕也同樣證實了IL-18基因轉(zhuǎn)染的肺癌細胞株增殖顯著減慢，轉(zhuǎn)移與侵襲能力顯著減弱，推測IL-18通過影響免疫功能與增加NK細胞的毒性效應(yīng)發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用。IL-18對腫瘤轉(zhuǎn)移程度影響的研究少，尚無可證實IL-18抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的確切報道〔9〕。以往研究〔10〕采用外周血單核細胞作為IL-18的擴增模板，在細胞組織研究中的可信度不高，本研究采用細胞逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA作為模板，不僅為研究IL-18提供了新的路徑，還可提高研究的可靠程度。

本研究提示IL-18在NSCLC的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。擴增的IL-18基因序列與GenBank公布的序列相符，無基因突變出現(xiàn)，揭示了IL-18在NSCLC高轉(zhuǎn)移中組成性表達。有關(guān)研究〔11〕表明IL-18通過促進肝血竇內(nèi)皮細胞的血管細胞黏附分子(VCAM-1)生成促進腫瘤肝轉(zhuǎn)移，但也有研究〔12〕表明IL-18通過降低IL-6水平抑制肝癌細胞的骨轉(zhuǎn)移。目前為止，對于IL-18在腫瘤中的生物學活性尚有爭議，有待進一步探討。

1 賴遠波，陳淡森.揭陽地區(qū)漢族人群白細胞介素18基因啟動子多態(tài)性與結(jié)核病的相關(guān)性〔J〕.廣東醫(yī)學，2013;34(16):2553-5.

2 周喜云.大腸癌術(shù)后患者營養(yǎng)狀態(tài)與血清中腫瘤壞死因子-α、IL-18和IL-23的關(guān)系〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(17):4340-1.

3 閉肇龍，侯恩存，吳 波，等.血清IL-18對肝細胞癌患者的預(yù)后價值〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013;23(22):34-7.

4 邵 奇，王 寧.白細胞介素-18與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究現(xiàn)狀〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2012;19(7):547-52.

5 Bian C，Wang ZC，Yang JL，et al.Up-regulation of interleukin-23 induces persistent allodynia via CX3CL1 and interleukin-18 signaling in the rat spinal cord after tetanic sciatic stimulation〔J〕.Brain Behav Immun，2013;1591(13):596-5.

6 陳志芬，鄧長生，馮茂輝，等.人白細胞介素-15與18協(xié)同增強腫瘤浸潤淋巴細胞體內(nèi)對結(jié)腸癌細胞的殺傷功能〔J〕.中華實驗外科雜志，2010;27(8):1041-5.

7 蔣常文，夏春波，李鴻文，等.外源性IL-18基因表達對C6膠質(zhì)瘤細胞侵襲力和克隆形成的影響〔J〕.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010;4(10):2001-3.

8 楊文剛，劉俊華，陳嘉寶，等.白細胞介素-18mRNA在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2011;19(12):2426-8.

9 蔣代鳳，邢桂春，陳筱瀟，等.白細胞介素18在肺癌細胞的表達及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中功能的初步探討〔J〕.免疫學雜志，2003;19(5):355-60.

10 蔣常文，夏春波，李鴻文，等外源性IL-18基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑對膠質(zhì)瘤C6細胞凋亡的誘導(dǎo)作用〔J〕.山東醫(yī)藥，2010;50(31):13-5.

11 張在云，李曉梅，王涓冬.IL-18基因修飾對肺癌細胞來源exosome誘導(dǎo)殺傷腫瘤細胞作用的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(9):1758-61.

12 Krzanowski M，Janda K.Dumnicka P-Relationship between aortic pulse wave velocity，selected proinflammatory cytokines，and vascular calcification parameters in peritoneal dialysis patients〔J〕.J Hypertens，2014;32(1):142-8.