大鼠骨髓間充質干細胞體外培養與pEGFP/Ang-1轉染方法的建立

李福智 侯 陽 李曉明 房 艷 臧東鈺 (遼寧醫學院附屬第三醫院胸外科，遼寧 錦州 000)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有兩個特性，一是所有干細胞具有自我更新的能力，即干細胞可以通過對稱分裂，形成兩個相同的干細胞以維持自身細胞群的數目;二是干細胞都具有分化能力，干細胞可以通過非對稱的分裂方式分裂，產生子代細胞并保持親代的特性。BMSCs移植為臨床各系統疾病損傷修復治療和細胞替代治療提供一種新的手段〔1，2〕。選用BMSCs，不僅可以用于缺失細胞的修補治療，也是有效的基因片段載體。Lou 等〔3〕及 Yoo等〔4〕的研究表明，BMSCs基因轉染率較高，經轉染后到達不同區域可分化為相應的組織，因而可以作為一個有效的載體進行基因治療。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑 4～6周齡的雄性SD大鼠4～6只，體重(110±10)g，由遼寧醫學院動物實驗中心提供。真核表達載體pEGFP-N1為遼寧醫學院解剖教研室提供。FUGENE HD轉染試劑為Ebiotrade公司生產(批號1118843)、L-DMEM培養基購置 HyClone公司(批號 NWF0426)、乙二胺四乙酸(EDTA)購置 Sigma公司(批號E6758)、胎牛血清(FBS)購置Thermo Fisher北京公司(批號NVA0227)、兔抗大鼠單克隆抗體CD 44、CD 45購置美國 BD公司(批號分別是55751，55752)。

1.2 BMSCs的培養及鑒定 采用貼壁篩選法〔5〕和密度梯度離心法〔6〕聯合操作獲取BMSCs:取4周齡SD大鼠2只，拉頸處死后，酒精浸泡消毒，剪除骨的兩端，用注射器吸取DMEM/F12培養基并含15%FBS 5 ml沖洗每根股骨。進行細胞計數，按1×107細胞/cm2接種于25 cm2培養瓶，置于培養箱中培養。基于細胞增殖和細胞密度融合時用含0.25% 胰蛋白酶0.02%EDTA的液消化后按1∶3的比例每3天進行分瓶。免疫組化檢測滴加一抗為兔抗大鼠單克隆抗體 CD44、CD45，實驗結果獲得純度較高BMSCs。CD44表達陽性，而CD 45表達陰性，證實培養的細胞為BMSCs。

1.3 FuGENE HD轉染試劑將重組表達質粒穩定轉染到BMCSs細胞內 將P2～P3代細胞置于6孔板;將 HD轉染試劑-質粒DNA混合物中，調節濃度為500 μg/ml的G418培養液進行篩選:選擇出在10～14 d內使細胞全部死亡的最低G 418濃度進行下一步的篩選試驗(本次篩選濃度為500 μg/ml)。同時用未加轉染液的細胞做對照。當對照細胞大部分死亡時(3～5 d后)，再換一次篩選液，G418濃度可降至150～250 μg/ml維持篩選作用。10～20 d后，可見有抗性克隆形成，待其逐漸增大后，將其逐一移至24孔板繼續培養。

1.4 蛋白印記檢測Ang-1在BMSCs中的表達 收集穩定轉染后的BMSCs和未轉染的BMSCs(密度為2×106個/ml)離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。加入細胞裂解液60～100 μl，短暫振蕩，冰上作用30 min，12 000 r/min離心5 min。聚遍氯乙烯(PVDF)膜在含有50 g/L脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TTBS)中37℃封閉90 min，依次加入一抗(抗鼠Ang-1抗體，抗體稀釋濃度為1∶1 000)，4℃孵育過夜，二抗(辣根過氧化酶標記的羊抗人IgG，抗體稀釋濃度為1∶1 000)顯色，觀察結果。進行凝膠圖像分析。

2 結果

2.1 BMSCs的形態學及免疫組織化學鑒定 在倒置顯微鏡下觀察接種時漂浮的單個核細胞呈圓形，在顯微鏡下觀察具有很強的折光性。在4～5 d貼壁的BMSCs呈短梭形或不規則形，傳至3代以后細胞逐漸變為長梭形，雜質細胞較少，細胞排列呈明顯的旋渦狀在瓶底清晰可見。免疫組織化學結果顯示幾乎所有BMSCs細胞CD 44表達陽性，而CD 45表達陰性，證實培養的細胞為BMSCs。見圖1，圖2。

2.2 Western印跡檢測BMSCs內重組蛋白的表達 轉染Ang-1的BMSCs有相應的Ang-1蛋白表達;未轉染的BMSCs未見Ang-1蛋白表達。見圖3。

2.3 轉染后BMSCs細胞的形態學結果 成功將pEGFP/Ang-1質粒轉入BMCSs，在熒光顯微鏡下觀察;1 d綠色熒光不明顯，3 d熒光最為明顯。見圖4。

圖1 光鏡下觀察傳至第3代的BMSCs(×200)

圖2 免疫組化染色檢測CD44(×200)

圖3 Western印跡鑒定重組融合蛋白的表達

圖4 轉染pEGFP/Ang-1質粒后熒光顯微鏡下形態(×100)

3 討論

BMSCs具有干細胞的共性，即具有自我復制和多向分化能力，在不同條件下可以分化所有中胚層來源的組織，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經膠質細胞、血管內皮細胞等〔7～10〕。根據細胞的大小和密度常可分離具有不同生物學特征的各種細胞亞群。根據本實驗條件摸索幾種簡便的方法，獲得純化效果較好。貼壁法:最常用的分離培養方法，除非有些特殊的細胞要求是懸浮培養，大部分細胞都適用于貼壁法。密度梯度離心法:常用Ficoll直接作為分離介質來分離細胞，但是高濃度Ficoll黏度較大，分離效果還很不理想，加入Hypaque可使分離液黏度降低，以提高分離效率。免疫選擇法:Phinney〔11〕采用一種免疫消耗技術，精確地將目的細胞造血細胞系和內皮細胞系從基質細胞中成功的分離出來。流式細胞儀分選法:此技術較為復雜，儀器昂貴，需專業技術人員進行操作，操作費時。本文在反復取材和多次培養BMCSs采用貼壁法和密度梯度離心法兩種方法相結合，細胞在傳至第一代時純度較高，傳第三代時純度可以達到95%。在鏡下觀察細胞變為紡錘形，細胞排列呈明顯的輻射狀或旋渦狀，此時細胞狀態最好，經多次傳代換液，細胞輪廓清楚，折光性強，生長迅速，少量集落排列呈漩渦狀。此時細胞處于有絲分裂中期更容易表達脂質體導入。接下來就是將含綠色熒光蛋白(GFP)的pEGFP-N1作為報告基因，證實目的基因在細胞內持續、高效、穩定地表達。在基因治療的載體有病毒載體和質粒載體被廣泛應用，脂質體作為基因轉移的載體具有低毒、使用方便等優點，而且具有一定的轉染效率〔12〕，該轉染技術近年來發展較快，試劑商品化和安全性好，因而目前廣泛應用于細胞基因轉染。在基因治療中將外源基因導入干細胞使其穿過細胞膜，進入細胞核表達是實驗成敗的關鍵，基因治療的最大優點是通過機體自身細胞分泌轉基因產物，避免了使用重組蛋白的昂貴費用。需要指出的是，本實驗中轉染效率仍偏低，這可能與載體細胞的特性和轉染方法有關，應采取措施提高轉染效率進一步改善基因治療的效果。

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