ERCC1單核苷酸多態性與老年非小細胞肺癌放療療效的相關性

周 憲 (重慶醫科大學附屬第一醫院腫瘤科，重慶 400030)

非小細胞肺癌(NSCLC)老年患者因發現時多數已是晚期〔1〕，已失去手術機會，因此放化療成為其主要治療手段。而一般認為腫瘤細胞DNA損傷修復能力與輻射敏感性密切相關。本文采用限制性長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術研究ERCC1 rs3212986 SNP與NSCLC老年患者放療療效的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月至2013年1月老年NSCLC患者采用三維適形放療或常規放療44例，男32例，女12例，年齡65～83歲，平均(71.2±4.3)歲;均為初次治療。卡氏評分≥80分32例，70～80分12例，病理類型:腺癌10例，鱗癌27例，腺鱗癌2例;未能分類2例，分化差的癌3例;T分期T1 3例，T2 18例，T3 10例，T4 13例;N分期:N1 2例，N2 22例，N3 20例。UICC分期:Ⅲa 19例，Ⅲb 25例;放療方案:三維適形26例;常規放療18例。

1.2 入組標準 經細胞學或病理證實為NSCLC的患者;全部為住院治療患者;卡氏評分＞70分;2002年UICCTNM分期為Ⅲ期;年齡60歲以上;無明顯心、肺、肝、腎功能異常;預計生存期3個月。患者簽署知情同意書后入組。

1.3 治療方法 常規分割治療18例，三維適形放療26例。常規放療患者仰臥于模擬機床，平靜呼吸，透視下所見腫瘤邊緣外放1～2 cm作為靶區，照射范圍包括原發病灶、同側縱隔和肺門，病灶位于上葉則照射野上界達隆突下3～5 cm，病灶位于下葉則下界達膈面。前后對穿野照射總量40 Gy后避開脊髓角度野照射，若鎖骨上出現淋巴結轉移則加照鎖骨上野。照射劑量為1.90～1.95 Gy/次，5次/w，總劑量為66～70 Gy，6～7 w完成。三維適形放療患者仰臥于三維立體定位框架床，雙臂上抬抱頭，真空負壓袋和熱塑體膜固定，平靜呼吸狀態下行胸部CT模擬定位和CT掃描，掃面范圍從胸廓入口至肋膈角水平，掃描層厚為0.5 cm，全部病例均做增強掃描。將CT影像資料轉到三維治療計劃系統。根據ICRU50號文件標準定義規定勾畫放療靶區，由放射診斷和放射治療科醫師共同勾畫大體腫瘤體積(GTV)，包括原發灶及轉移淋巴結，放射靶區(CTV)的邊界為CT肺窗條件下GTV外1 cm(不包括預防照射淋巴結引流區)，CTV外放5 mm為計劃靶體積(PTV)。利用射野方向觀(BEV)進行照射野設計，以PTV中心為射野等中心，通過劑量體積直方圖(DVH)進行治療計劃優化，一般采用4～6個共面射線束，靶區劑量采用90%的等劑量曲線腫瘤劑量為200 Gy/次，5次/w的常規分割，總劑量66 Gy。同時保證肺V20≤25%，脊髓≤40 Gy，食管≤50 Gy。

1.4 療效觀察及毒性評定 治療1～3個月，近期療效按WHO制定的實體瘤近期療效評定標準評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無變化(NC)和進展(PD)。放療毒副作用按照美國腫瘤放射治療協作組(RTOG)分級標準分為0～4級。

1.5 人切除修復交叉互補基因(ERCC1)分析 取患者抗凝外周血樣本100 μl，用磁珠法提取DNA。操作流程參照MzgaZorb DNA微量提取試劑盒(BioFlux公司產品)說明書進行。PCRRFLP基因分型引物采用PIRA-PCR在線工具及primer premier軟件設計。正義:5'-CCGGAGGCTGTTTGATGT，反義:CAGTGCCCCAAGAGGAGAT，PCR 產物 332 bp，酶切產物 CC:332 bp，AA:239/93 bp，CA:332/239/93 bp。見表2。PCR條件為95℃預變性 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環后72℃延伸10 min。酶切反應為15 μl體系，包括12 μl PCR產物，1×酶切反應緩沖液和3 U MboⅡ內切酶。37℃水浴3 h，3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統分析，判斷基因型。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗，kaplanmeier生存分析及logrank分析。

2 結果

2.1 ERCC1 rs3212986多態位點與放療敏感性分析 ERCC1 rs3212986多態位點CC、CA和AA三種基因型中，放療敏感性(CR和PR)和不敏感(NC和PD)患者的分布比分別是6例(30%)和14例(70%)、7例(36.8%)和 12例(63.2%)、3例(60%)和2例(40%)，顯著改善放療患者療效的AA基因型。與CC基因型患者比較，CA和AA基因型患者對放療更敏感，近期療效更好。攜帶CA基因型患者和攜帶AA基因型患者放療更加敏感，OR值分別達到1.31(95%CI=0.59～2.62，P=0.542)和5.63(95%CI=1.01-20.37，P=0.028)。研究發現，隨著A等位基因數量的增加，患者放療的療效逐漸變好，放療敏感性逐漸增加，患者對放射治療敏感程度的增加與其攜帶A等位基因數目的增加保持一致。攜帶AA基因型患者是三種基因型中放療最敏感、近期療效最好的患者，敏感程度是不攜帶A等位基因(CC基因型)患者的2.46倍，差異有統計學意義(P=0.041)。而攜帶一個A等位基因的患者其放療敏感性是不攜帶A等位基因患者的1.46倍(95%CI=0.81～2.57，P=0.185)。此外，常規放療與適形放療患者不同基因型之間的療效比較差異無統計學意義(P=0.502、0.495)。

2.2 各臨床因素和NSCLC放療結局的危險度評價 性別、年齡、病理、治療方法等因素對治療結局無明顯影響(均P＞0.05);基因型、分期對治療結局有明顯影響(P＜0.05)。患者ERCC1 rs3212986 SNP對放療毒副作用無明顯影響(P＞0.05)。見表1。

表1 各臨床因素和NSCLC放療結局的危險度評價

3 討論

臨床上觀察到同樣的病例給予同樣的放療方案，患者的放療反應和最終療效也有一定的差異。若能找到能預測放療敏感性的生物標志物，就可能設計出個體化的放療方案，提高療效并減少不必要的放療反應。

研究表明，電離輻射可造成DNA結構和功能損傷，而DNA損傷修復過程中許多基因起著不同的重要作用，這些基因的SNPs可改變蛋白質表達水平或功能，進而改變DNA修復能力，這為檢測此類基因的SNPs來預測放療敏感性提供了思路。

近年來隨著腫瘤分子生物學的發展，已發現ERCC1的表達水平和放療療效及預后密切相關。回顧迄今國內外針對耐藥基因與放療進行的許多研究及臨床試驗發現，ERCC1過表達者易獲得較差療效，而ERCC1的表達往往與其SNP相關〔1〕。

ERCC1基因編碼的蛋白在核苷酸切除修復中發揮重要作用，同時，也參與了如紫外線或者順鉑類親電子復合物所造成的DNA損傷修復過程〔1〕。ERCC1可催化DNA重組修復和鏈間交聯修復。ERCC1蛋白突變或者表達量的變化都有可能影響細胞DNA損傷修復能力。

近年來的研究表明，ERCC1 rs3212986位點SNP與直腸癌患者接受新輔助放化療療效相關，并且該位點攜帶不同基因型的患者ERCC1蛋白表達水平不相同。ERCC1蛋白的表達水平與接受鉑類藥物治療患者的藥物抵制及放療療效相關聯〔2〕。研究分析了術后放療的NSCLC患者ERCC1 SNP與正常組織放療敏感性相關，發現ERCC1 rs3212986位點SNP與放療導致毛細血管擴張癥和皮下纖維化的發生密切相關〔3〕。

研究分析發現ERCC1 SNP或低表達患者中使用個體化治療獲得更高的有效率，但并未發現能延長疾病無進展生存期及總生存期〔4〕。

目前研究主要集中于DNA修復基因SNP位點與腫瘤易感性的相關，而其預測癌癥療效的研究才剛剛起步〔5〕。本研究結果發現，上述SNP差異與放療療效相關，該位點不同基因型NSCLC老年患者放療的近期療效不同。攜帶CA基因型患者和攜帶AA基因型患者放療更加敏感，隨著A等位基因數量的增加，患者放療的療效逐漸變好。原因可能是該位點SNP的變化導致ERCC1表達量出現變化，進而影響DNA損傷后修復功能。

1 Sakano S，Ogawa S，Yamamoto Y，et al.ERCC1 and XRCC1 expression predicts survival in bladder cancer patients receiving combined trimodality therapy〔J〕.Mol Clin Oncol，2013;1(3):403-10.

2 Páez D，Salazar J，Paré L，et al.Pharmacogenetic study in rectal cancer patients treated with preoperative chemradiotherapy:polymorphisms in thymidylate synthase，epidermal growth factor receptor，GSTP1，and DNA repair genes〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011;81(5):1319-27.

3 Gandara DR，Grimminger P，Mack PC，et al.Association of epidermal growth factor receptor activating mutations with low ERCC1 gene expression in non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol，2010;5(12):1933-8.

4 Mountzios G，Vitae，Dimopoulos MA，et al.Histopathologic and genetic alterations as predictors of response to treatment and survival in lung cancer:a review of published data〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2010;75(2):94-109.

5 Roth JA，Carlson JJ.Prognostic role of ERCC1 in advanced non-smallcell lung cancer:a systematic review and meta-Analysis〔J〕.Clin Lung Cancer，2011;12(6):393-401.