膠原和鈣結合EGF域1的表達與直腸癌組織淋巴管生成及預后的關系

李文媛 王 瑩 劉艷翠 尹國華 馮克儉 (牡丹江醫學院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 570)

癌細胞經淋巴道轉移是直腸癌最重要的轉移方式和影響預后的最主要因素之一〔1〕，因而研究直腸癌淋巴管生成和轉移機制具有重要的臨床價值。膠原和鈣結合EGF域1(Ccbe1)是Hogan等〔2，3〕報道的一種新發現的淋巴管生成因子，在人類和斑馬魚的淋巴管發育和生成過程中發揮重要作用，并具有調節細胞外基質重塑及遷移的功能〔4〕，其表達上調能夠促進腫瘤細胞遷移和存活。迄今為止，Ccbe1參與調控淋巴管生成的具體機制尚未清楚。本研究探討直腸癌中Ccbe1的表達及其與淋巴管密度、淋巴結轉移和直腸癌預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取牡丹江市腫瘤醫院2007年12月至2010年5月原發直腸癌患者45例。女17例，男28例，年齡≥60歲26例;＜60歲19例。按世界衛生組織(WHO)病理分型標準:高分化27例，中分化15例，低分化3例。Dukes A期5例、B期7例、C期21例、D期12例。淋巴結轉移16例。對照組20例，均為直腸息肉手術切除病例。隨訪至2011年6月20日，隨訪時間為4～60個月，平均36個月。

1.2 主要試劑 Ccbe1抗體和LYVE-1抗體購自美國Sigma公司，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Trizol試劑、SuperscriptⅡ反轉錄酶、dNTPs購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標志物購自Takara公司，Ccbe1和β-actin引物由大連寶生物合成。

1.3 免疫組織化學染色 嚴格按照免疫組化試劑盒說明的步驟進行，其中一抗濃度Ccbe1(1∶100)、LYVE-1(1∶200)。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。評分標準按照細胞著色強度(無0分;弱1分;中2分;強3分)和切片中陽性細胞率評分(≤5%，0分;6% ～0%，1分;11% ～20%，2分;21% ～50%，3分;＞50%，4分)之和為該病例評分值，將評分值≤2分為陰性，≥3分為陽性。LVD定量分析:先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區域，在高倍鏡下計數5個視野淋巴管數，取其均值作為該切片淋巴管數。

1.4 實時熒光定量PCR檢測 總RNA提取，采用Zacharek等〔5〕報道方法進行PCR反轉錄、檢測及熒光定量分析。引物設計及合成按照已報道的序列設計并合成Ccbe1以及內參照β肌動蛋白β-actin的特異性引物。各引物的序列為:Ccbe1:上游5’-CTTGGGAAGGCAAGACTCAC-3’，下游5’-AGCCCCTGAT-GAAGGAGTTT-3’;β-actin:上游 5-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3，下游5-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3。分析方法采用2-△△CT方法。

1.5 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行χ2檢驗、t檢驗、LSD法和Kaplan-Meier生存分析。

2 結果

2.1 Ccbe1的表達情況 Ccbe1陽性表達位于細胞質和細胞膜內，呈棕黃色顆粒狀，陰性細胞胞質和胞膜不著色。Ccbe1在直腸癌組織中的陽性表達率為68.8%，明顯高于直腸息肉組中陽性表達率(25.0%)(χ2=10.794，P ＜0.01)。

2.2 Ccbe1表達與臨床病理特征的關系 在各種臨床因素中，Ccbe1蛋白表達與Ducks分期、淋巴結轉移密切相關(P＜0.01)，而與年齡、性別及腫瘤分化程度各組間的差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 Ccbe1在直腸癌組織中的陽性表達(n)

2.3 Ccbe1表達與LVD的關系 LYVE-1特異性地表達在直腸癌組織中淋巴管內皮細胞，呈棕色管腔。Ccbe1陽性組LVD(14.65±0.84)顯著高于陰性組(10.10±0.52)(t=9.145，P＜0.01)。

2.4 實時熒光定量PCR的擴增效率檢測 直腸癌組織中淋巴結轉移組(0.104±0.011)和無淋巴結轉移組(0.067±0.006)Ccbe1 mRNA的相對表達較聲帶息肉組(0.041±0.002)明顯增加(P=0.000)，有淋巴結轉移組中Ccbe1 mRNA表達顯著高于無淋巴結轉移組(F=68.286，P＜0.01)。

2.5 生存率分析 Ccbe1陽性組平均生存時間〔(44.41±5.61)個月〕，明顯低于陰性組〔(61.70±4.81)個月〕，Log rank檢驗表明Ccbe1陽性表達與生存曲線負相關(χ2=4.059，P＜0.05)。

3 討論

約40%的直腸癌病例確診時已發生遠處轉移，而淋巴管轉移是直腸癌主要轉移方式〔1〕。最近發現的癌基因Ccbe1一種分子量為44 kD的蛋白，這種蛋白包含許多可供識別的結構單位，包括可結合一個天冬氨酸/天冬酰胺羥基化位置的EGF樣區域，此區域具有細胞活力相關蛋白的重要特征〔2〕。目前關于Ccbe1對腫瘤的作用尚不明確，有研究〔4，6〕發現 Ccbe1基因具有調節細胞外基質重塑及遷移的功能，其表達上調能夠促進腫瘤細胞遷移和存活。但有研究〔7〕發現Ccbe1在卵巢癌細胞株和卵巢原發癌中顯著下調，并與卵巢癌的腫瘤分化、腫瘤分級和低存活率負相關。本研究推測Ccbe1能夠促進直腸癌的發生和轉移。本研究還提示檢測直腸癌患者Ccbe1的表達將有望成為判斷直腸癌預后的新指標。

Hogan等〔2〕發現Ccbe1是淋巴管萌芽和淋巴管靜脈內皮細胞從主靜脈遷移的關鍵因素，沉默Ccbe1基因可致淋巴管不能從原始的靜脈發芽并形成脊索旁淋巴前體，導致斑馬魚淋巴管發育受阻并引起水腫，而Alders等〔3〕對人類 Hennekam淋巴管擴張癥研究也證實了這一結果。在本試驗中直腸癌組織中Ccbe1表達與淋巴管密度密切相關，證實了Ccbe1能夠促進直腸癌淋巴管生成，我們推測其機制可能與Ccbe1能夠顯著地增強血管內皮生長因子-C表達，進而促進淋巴管生成表達有關〔8〕，但其具體作用機制仍需進一步研究和證實。

綜上，Ccbe1能夠促進直腸癌淋巴管生成和淋巴管轉移，Ccbe1的檢測將有望成為判斷直腸癌患者預后的一個新指標。

1 黃景山.老年直腸癌患者188例預后因素分析〔J〕.中國老年學雜志，2011;9(31):3260-2.

2 Hogan BM，Bos L，Bussmann J，et al.Ccbe1 is required for embryonic lymphangiogenesis and venous sprouting〔J〕.Nature Genet，2009;41(4):396-8.

3 Alders M，Hogan BM，Gjini E，et al.Mutations in CCBE1 cause generalized lymph vessel dysplasia in humans〔J〕.Nature Genet，2009;41(12):1272-4.

4 Barton CA，Gloss BS，Qu W，et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival〔J〕.Br J Cancer，2010;102(1):87-96.

5 Zacharek A，Chen J，Cui X，et al.Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke〔J〕.Cereb Blood Flow Metab，2007;27(3):1684-91.

6 王 瑩，李文媛，張大偉，等.Ccbe1在喉癌中的表達及其臨床意義.山西醫科大學學報，2012;43(1):58-61.

7 Hauptmann S，Denkert C，Koch I，et al.Genetic alterations in epithelial ovarian tumors analyzed by comparative genomic hybridization〔J〕.Hum Pathol，2002;33(6):632-41.

8 Bos FL，Caunt M，Peterson J，et al.CCBE1 is essential for mammalian lymphatic vascular development and enhances the lymphangiogenic effect of vascular endothelial growth factor-C in vivo〔J〕.Circ Res，2011;109(5):486-91.