HPLC法測定1，2-環己烷二甲醇中非對映異構體的含量

郭文敏，李清娟，張 琪，陳素銳，邢 浩[.石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司，石家莊 050035；.石家莊職業技術學院，石家莊 05008]

鹽酸魯拉西酮（Lurasidone hydrochloride，商品名為Latuda）是第2代抗精神分裂癥新藥，于2010年10月28日被美國FDA批準上市，用于成人的精神分裂癥。其作為一種具有雙重作用的抗精神分裂癥治療藥物[1-3]，同時作用于多巴胺D2受體、5-羥色胺（5-HT）7受體、5-HT1a受體、5-HT2a受體、α2c-腎上腺素受體，除可抑制注意缺陷多動障礙外，還可有效抑制5-HT2受體介導的行為，可劑量依賴性地顯著抑制緩解條件性恐懼應急所致的僵滯行為。1，2-環己烷二甲醇（以下簡稱環己烷二甲醇）是鹽酸魯拉西酮合成中的關鍵起始原料，在合成反應中，環己烷二甲醇中的非對映異構體也參與反應，生成鹽酸魯拉西酮的異構體雜質，但在工藝中除去較為困難，因此嚴格控制環己烷二甲醇中非對映異構體的含量是合成中的一個關鍵控制點，但目前關于環己烷二甲醇中非對映異構體的檢測方法尚未見文獻報道。筆者建立了采用示差折光檢測器[4-7]測定環己烷二甲醇中非對映異構體雜質的高效液相色譜（HPLC）方法，結果表明建立的方法準確、快速，為有效控制終產品鹽酸魯拉西酮中的光學異構體雜質提供了方法，為該產品的質量控制提供了保障。

1 材料

1.1 儀器

e2695 HPLC儀、2414示差折光檢測器（美國Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

環己烷二甲醇對照品（批號：20120901，純度：99.85%）、環己烷二甲醇非對映異構體對照品（批號：20120902，純度：99.69%）、環己烷二甲醇原料藥（批號：20120301、2012302、2012303，純度：99.76%、99.71%、99.79%）均由石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司提供；甲醇為色譜純，甲酸銨為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與檢測器條件

色譜柱：Agilent Rx C8（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.01 mol/L甲酸銨緩沖溶液（pH 3.0）-甲醇（70∶30），流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；柱溫：35 ℃；檢測器內部溫度：35 ℃，外部溫度：35 ℃；采樣速率：2.50 μl/s，過濾時間常數：1.0 s；極性：+；靈敏度：1250.0 nRIU/mV。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取原料藥約100 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取環己烷二甲醇與環己烷二甲醇非對映異構體對照品各適量，分別置于10 ml量瓶中，加流動相溶解制成含環己烷二甲醇約為10 mg/ml、環己烷二甲醇非對映異構體0.01 mg/ml的溶液，搖勻，濾過，即得。

2.4 專屬性考察

分別精密稱取環己烷二甲醇與環己烷二甲醇非對映異構體對照品適量，加流動相溶解分別制成各自的對照品溶液及2種對照品的混合對照品溶液。依次精密吸取上述3種溶液及供試品溶液各20μl注入色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，環己烷二甲醇峰與其非對映異構體峰的保留時間分別約為11、8 min，2個色譜峰之間分離度大于2.0，理論板數均高于5000，色譜圖見圖1。

2.5 線性關系與響應因子考察

圖1 高效液相色譜圖A.環己烷二甲醇對照品；B.環己烷二甲醇非對映異構體對照品；C.供試品；D.混合對照品；1.環己烷二甲醇；2.環己烷二甲醇非對映異構體Fig 1 HPLC chromatogramsA.cyclohexanedimethanol control；B.cyclohexanedimethanol diastereoisomer control；C.test sample；D.mixed control；1.cyclohexanedimethanol；2.cyclohexanedimethanol diastereoisomer

分別精密稱取環己烷二甲醇對照品和環己烷二甲醇非對映異構體對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成含環己烷二甲醇分別為0.01、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/ml與非對映異構體分別為10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的對照品溶液；分別精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄峰面積，以質量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得環己烷二甲醇及其非對映異構體的線性方程分別為：A＝2985.5c+12.9（r＝0.9999，n＝6）、A＝2981.1c+9.5（r＝0.9999，n＝5）。結果表明，環己烷二甲醇及其非對映異構體檢測質量濃度線性范圍分別為0.01～10.0 mg/ml、10.0～200.0 μg/ml；且以環己烷二甲醇響應因子為1計，環己烷二甲醇非對映異構體的相對響應因子為0.996。

2.6 精密度試驗

分別精密吸取環己烷二甲醇（10.0 mg/ml）及其非對映異構體（100.0 μg/ml）的對照品溶液20 μl，重復進樣5次，測得二者峰面積的RSD分別為0.42%、0.44%（n＝5），表明方法精密度良好。

2.7 檢測限與定量限試驗

采用逐級稀釋的方法制備系列質量濃度的環己烷二甲醇非對映異構體對照品溶液，進樣測定。當信噪比≥10時，環己烷二甲醇非對映異構體的定量限為31 ng；當信噪比≥3時，環己烷二甲醇非對映異構體的檢測限為10 ng。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20120301）共5份，分別制備成供試品溶液，進樣測定，結果樣品中環己烷二甲醇和非對映異構體雜質的含量分別為99.76%、0.24%，RSD分別為1.39%、1.96%（n＝5）。

2.9 回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20120301，環己烷二甲醇及其非對映異構體的含量分別為99.76%、0.24%）約100 mg各9份；于9份樣品中依次精密加入環己烷二甲醇非對映異構體對照品溶液（0.3040 mg/ml）0.4、0.8、1.2 ml各3份，并制備成供試品溶液。分別精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表1。

2.10 溶液穩定性考察

取“2.8”項下供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h時精密吸取20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積。結果環己烷二甲醇及其非對映異構體峰面積的RSD分別為0.65%、0.69%（n＝6）。結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1Results of recovery test（n＝3）

2.11 耐用性考察

依據2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪⅩA關于藥品質量標準分析方法驗證指導原則[8]，以主峰理論板數、主峰與相鄰雜質峰的分離度為評價指標，分別選用以辛烷基硅烷鍵合硅膠為固定相、不同品牌的色譜柱（柱1：Agilent；柱2：Waters；柱3：Phenomenex），不同pH（2.9、3.0、3.1）的0.01 mol/L甲酸銨緩沖溶液，不同流動相比例，不同流速，不同柱溫進行方法優化，最終確定了本試驗的最佳分離分析條件即“2.1.1”項下條件。具體試驗結果見表2。

表2 方法耐用性考察結果Tab 2 Results of robustness test

2.12 樣品含量測定

取3批樣品制備成供試品溶液后進樣測定，計算樣品中環己烷二甲醇非對映異構體雜質的含量，結果分別為0.19%、0.27%、0.21%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

由于環己烷二甲醇與其非對映異構體為極性較為相似的化合物，前期試驗中分別采用以辛烷基硅烷鍵合硅膠、十八烷基硅烷鍵合硅膠、氨基鍵合硅膠為填料的色譜柱進行分析。結果表明，采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，環己烷二甲醇與其非對映異構體的色譜峰峰形良好、柱效最佳；經考察不同品牌的辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，結果表明均符合要求，本文擬定方法良好。

3.2 流動相組成的優化

由于示差折光檢測器屬于光學檢測器，流動相中存在的微小氣泡會使基線不穩，甚至影響檢測，因此流動相在臨用前應將緩沖溶液與有機相按比例混為一相、進行脫氣后方可使用。因此本測定方法中的流動相組成是首先借助蒸發光散射檢測器進行優化確定后，再采用示差折光檢測器進行方法學驗證研究。在選用流動相體系時，使用甲酸銨緩沖溶液，調pH為3.0，可使二者的分離度與峰形達到最佳；在有機相的選擇過程中，經試驗篩選使用甲醇更優，且可調空間較大。

3.3 其他應用

本方法除可用于測定環己烷二甲醇中的非對映異構體雜質外，亦可用于環己烷二甲醇及其非對映異構體的含量測定。

[1]封宇飛.抗精神病新藥魯拉西酮的藥理與臨床研究進展[J].中國新藥雜志，2011，20（10）：853.

[2]Citrome L.Lurasidone for schizophrenia：a brief review of a new second-generation antipsychotic[J].Clin Schizophr Relat Psychoses，2011，4（4）：251.

[3]Citrome L.Lurasidone for schizophrenia：a review of the efficacy and safety profile for this newly approved second-generation antipsychotic[J].Int J Clin Pract，2011，65（2）：189.

[4]徐燁，李麗君，王乃芝，等.高效液相色譜法測定飲料中防腐劑和甜味劑[J].食品科學，2008，29（6）：339.

[5]戴傳波，李建橋，胡清.采用帶示差折光檢測器的高效液相色譜法檢測肌醇[J].化學工業與工程技術，2006，27（4）：57.

[6]龔時瓊.高效液相色譜儀常用檢測器的使用與維護[J].現代儀器，2009，16（1）：55.

[7]顧云，李海生.高效液相色譜法用于蜂蜜的分析及其品質評價[J].天津藥學，2001，13（2）：49.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄194-195.