腎移植患者嗎替麥考酚酯血藥濃度監測

彭明麗，趙冠人，申 健（解放軍309醫院藥劑科，北京 100091）

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是麥考酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯類衍生物，MPA通過非競爭性抑制嘌呤合成途徑中次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的活性，抑制T、B淋巴細胞的增殖反應，發揮免疫抑制作用，具有高效、高選擇性、非競爭性、可逆性的藥理學特質，臨床上主要用于肝、腎、心臟及骨髓移植中排斥反應的預防和治療[1]。

MPA的免疫抑制效果明顯，但藥物過量時其藥品不良反應（adverse drug reaction，ADR）同樣不可忽視。麥考酚酸的蛋白結合率為97% ～ 99%，藥動學個體差異大，且藥動學與其免疫抑制效果及ADR的發生有密切的關系[2]。MMF的有效治療窗比原有概念中的治療窗窄，且急性排斥反應與毒副反應的發生率與血藥濃度相關性大[3]，因此，開展MMF治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）有一定的臨床意義。使用TDM指導MMF臨床用藥，其目標是通過TDM使器官移植患者在使用MMF時達到最佳治療效果且ADR發生率降至最低，從而使MMF的臨床用藥真正做到個體化，為器官移植患者帶來更大的益處。

為了進一步探討對MMF進行TDM的臨床意義，我們選取了83例服用MMF的本院腎移植患者，對其血藥濃度進行測定，并對數據進行分析。

1 材料

1.1 資料來源

選取2012年10 – 12月在我院住院或門診定期監測血漿MPA的腎移植患者，共83例。其中，服藥前血藥濃度（C0）46例，服藥后2 h血藥濃度（C2）37例。在C0測定的免疫抑制用藥方案中，與環孢素（CsA）聯用的C0共37例，與他克莫司（FK506）聯用的C0共9例。男性52例，女性31例，年齡16 ～ 61歲，平均年齡（42.2±26.2）歲，平均體質量（56.6±12.2） kg。

1.2 儀器與試藥

島津HPLC液相系統，包括LC-10ATvp雙泵、SPD-M20A二級管陣列檢測器、CTO-10Avp柱溫箱、SIL-10ADvp自動進樣器、SCL-10Avp系統控制器、DGU-10A脫氣裝置、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；5417R臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；XW-80A漩渦混合器（上海醫科大學儀器廠）。

MPA對照品（Sigma公司，含量：98%，批號019k4106）；萘啶酸對照品（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，含量：99.5%，批號00621）；乙腈為色譜純（Dikma公司）；三氟乙酸為色譜純（Dikma公司）；水為Millipore制備超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

2 方法

2.1 免疫抑制用藥方案

對腎移植術后的患者采用CsA+MMF+潑尼松（Pred）或FK506+MMF+Pred三聯免疫抑制方案。MMF于手術當日開始口服，起始劑量為1.5 g·d-1；腎移植術后FK506起始劑量為0.15 mg·kg-1·d-1；CsA起始劑量為60.15 mg·kg-1·d-1；手術當日起靜注Pred（0.5 g，qd），至術后第3天改為口服Pred，起始劑量為40 mg·d-1，逐漸減量。

2.2 血樣采集

采血時間為晨起給藥前及給藥后2 h，取靜脈血2 mL，置EDTA-Na真空抗凝管中，當日測定血漿中MPA濃度。

2.3 血藥濃度測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（40∶60）；檢測波長：215 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：20 μL。

2.3.2 MPA標準溶液與內標萘啶酸溶液的配制 精密稱取MPA對照品12.49 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為499.60 μg·mL-1的MPA標準溶液；精密稱取萘啶酸對照品6.01 mg，置于50 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為120.20 μg·mL-1的內標萘啶酸溶液，以上溶液置于6 ℃冰箱儲存。

2.3.3 血漿樣品處理 取血漿樣品200 μL于1.5 mL離心管，加入內標20 μL，乙腈600 μL，旋渦混合，14 000 r·min-1離心15 min，取上清液20 μL，進樣。

2.3.4 專屬性實驗 本實驗條件下，麥考酚酸及內標萘啶酸有對稱的色譜峰和良好的分離度，血漿中雜質峰及合用的其他藥品峰不干擾樣品的測定，本方法具有較高的專屬性，見圖1。

圖1 麥考酚酸和萘啶酸色譜圖A – 對照品，B – 空白血漿，C – 血漿樣品，D – 合用環孢素患者血漿樣品，E – 合用FK506患者血漿樣品；1 – 麥考酚酸，2 – 萘啶酸Fig 1 Chromatograms of MPA and nalidixic acidA – standard, B – blank plasma, C – MPA and nalidixic acid standard added in blank plasma, D – plasma of patient taking CsA, E – plasma of patient taking FK506; 1 – mycophenolic acid, 2 – nalidixic acid

2.3.5 標準曲線與線性范圍 取人空白血漿180 μL，分別加入MPA標準溶液適量，精密配制成質量濃度分別為0.20、0.50、1.00、5.00、9.99、19.98、49.96 μg·mL-1的血漿樣品，按“2.3.3”項下方法處理，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。以樣品與內標峰面積比值（Y）對濃度（C）進行回歸計算，結果表明MPA在0.20 ～ 49.96 μg·mL-1范圍內線性良好，得回歸方程為：Y = 0.665 76C – 0.012 057，r = 0.999 6。在上述條件下測得血漿中MPA最低檢測濃度為0.20 μg·mL-1。2.3.6 精密度和準確度實驗 分別于180 μL的空白血漿中加入低、中、高3種濃度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的麥考酚酸對照品溶液20 μL，混勻，得低、中、高3種不同濃度麥考酚酸的血漿樣品，按“2.3.3”項下方法處理，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，依法測定日內與日間（3 d內）精密度，結果見表1。分析可知，日內RSD均小于10%，日間RSD均小于15%，符合規定。

表1 麥考酚酸的相對回收率和精密度Tab 1 Relative recovery and precision of MPA

2.3.7 麥考酚酸穩定性考察 取已知麥考酚酸濃度血漿樣品數份，分別置室溫條件下存放0、1、2、4、8、16、24 h后，按血漿樣品的處理與測定方法操作，測定麥考酚酸濃度，考察樣品放置穩定性。結果血漿樣品在室溫放置24 h穩定，RSD均小于15%，同時考察了樣品在– 20 ℃冰箱中存放一個星期的穩定性，測得結果表明樣品穩定，RSD均小于15%，符合規定。

2.3.8 回收率實驗 分別于180 μL的空白血漿中加入低、中、高3種濃度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的麥考酚酸對照品溶液20 μL，混勻，得低、中、高3種不同麥考酚酸濃度的血漿樣品，按血漿樣品的處理及測定方法操作，結果麥考酚酸平均回收率均大于90%，RSD均小于3%，見表2。

表2 麥考酚酸的提取回收率Tab 2 The extraction recovery of MPA

2.3.9 樣品測定 取46名患者給藥前血漿（C0）及37名患者給藥后2 h血漿（C2），按“2.3.3”項下血漿樣品處理方法操作，取上清液20 μL按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，另取含麥考酚酸低、中、高濃度（0.50、5.00、19.98 μg·mL-1）的血漿樣品各3份，作為質控隨行測定，RSD均小于3%。根據內標法加校正因子法計算MPA濃度。

2.4 統計學方法

不同免疫抑制方案MPA谷濃度（C0）數據的比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 MPA谷濃度（C0）測定結果的分布

血漿MPA谷濃度范圍為0.34 ～ 3.99 μg·mL-1，測定值的分布情況見表3。谷濃度與抗排斥效果相關較大，由表3可見，按治療窗1.0 ～ 3.5 μg·mL-1計算[4]，有效率為47.83%。

表3 血漿MPA C0測定值的分布Tab 3 Range distribution of C0 about MPA in plasma

3.2 不同免疫抑制方案中MPA谷濃度（C0）的測定結果

與CsA聯用方案中，MPA谷濃度范圍為0.17 ～3.05 μg·mL-1，谷濃度平均值為（1.26±0.78）μg·mL-1；與FK506聯用方案中，MPA谷濃度范圍為0.03 ～ 3.99 μg·mL-1，谷濃度平均值為（1.43±1.22）μg·mL-1，二者具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

3.3 MPA峰濃度（C2）測定結果的分布

血漿MPA峰濃度范圍為0.91 ～ 12.78 μg·mL-1，測定值的分布見表4。MPA峰濃度與不良反應的發生相關性較大，由表4可見，將濃度范圍未達到2.00 μg·mL-1計為無效果[4]，則無效率為21.62%；將濃度范圍高于10.00 μg·mL-1計為中毒[4]，則中毒率為8.11%。

表4 血漿MPA C2測定值的分布Tab 4 Range distribution of C2 about MPA in plasma

4 討論

MMF是預防和治療異體肝、腎和心臟移植后器官排斥反應的免疫抑制藥物，口服后可迅速經腸道吸收，脫酯化后轉化為有活性的MPA從而發揮免疫抑制作用。由于MPA的治療窗窄，藥動學過程個體差異大，因此對其開展TDM有重要的臨床意義。MPA藥動-藥效相關性表明，0 ～ 12 h內曲線下面積（AUC0-12）是預測急性排異相關性最好的指標，但傳統的AUC0-12方法采血點多，患者依從性差，檢測成本高，臨床上難以實施。報道[5]指出，MPA谷濃度C0與急性排斥反應相關性較大，峰濃度與毒副反應相關性較大，因此本文依據此二者作為MMF效應評價指標。

有關血漿中MPA濃度的檢測，研究報道有酶聯免疫法[6]、液質聯用法[7]、高效液相色譜-熒光檢測法[8]等，這些方法往往具有特異性不強、成本高、處理方法復雜等特點，難以普及應用。我們建立了一種簡便、快速測定移植患者血漿中MPA濃度的高效液相色譜法，可用于常規血藥濃度的監測。

本文測定結果顯示，與CsA聯用時MPA谷濃度范圍為 0.17 ～ 3.05 μg·mL-1，谷濃度平均值為（1.26±0.78） μg·mL-1；與FK506聯用時MPA谷濃度范圍為0.03 ～ 3.99 μg·mL-1，谷濃度平均值為（1.43±1.22） μg·mL-1，比與CsA聯用時谷濃度明顯升高（P ＜ 0.05），這可能是由于FK506可提高MMF的生物利用度，同時抑制了MPA的葡醛酸化所致。值得注意的是，MMF劑量的增加通常伴隨著CsA AUC的升高，且糖皮質類激素的劑量與MMF的生物利用度呈負相關[9]。鑒于相關藥物間復雜的相互作用，在免疫抑制聯合用藥方案中，TDM就顯得尤為重要。

另外，MPA谷濃度與峰濃度測定結果的分析表明，按單一劑量服用MMF引起的個體差異較大，有效率較低可能與患者病理狀態和藥物相互作用有關；出院患者血藥濃度個體差異較大，可能與服藥依從性差有關，因此對于服用 MMF的患者進行TDM具有更重要的臨床意義。