依普利酮對急性腎病大鼠尿蛋白含量及腎小球足細胞標記蛋白表達的影響

王 穎，肖卓韜，施 輝，潘金林

(1南通大學，江蘇南通226001;2南通大學附屬醫院;3南通大學附屬丹陽醫院)

目前研究認為，足細胞在蛋白尿的發生機制中起重要作用。嘌呤霉素氨基核苷(PAN)腎病模型是一種與人類腎病綜合征相似的典型動物模型，有關醛固酮受體(MR)拮抗劑對該模型療效和治療機制的研究較多。2013年2月，我們觀察了MR拮抗劑依普利酮對PAN急性腎病大鼠尿蛋白和腎小球足細胞標記蛋白表達的影響，以期為腎病綜合征防治提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性清潔級SD大鼠32只，6周齡，體質量(200±20)g，購自南通大學實驗動物中心，分籠飼養，保持室內相對濕度60% ±5%、溫度22℃～25℃，室內12 h明暗自動切換，自由飲水，普通飼料清潔級喂養。PAN(美國ENZO)，依普利酮(美國輝瑞)，兔抗β-actin多克隆抗體、兔抗鼠Nephrin抗體、兔抗鼠Podocalyxin抗體(均購自美國Santa Cruz公司)，兔抗人足細胞抗體(武漢Boster公司)，DAB試劑盒(北京中衫金橋)，高純度總RNA快速抽提試劑盒—離心柱型(北京博凌科為)，逆轉錄試劑盒(美國Fermertas)，熒光定量PCR試劑盒、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs，日本TaKaRa公司)，總蛋白提取液、ECL發光試劑盒、羊抗兔二抗(均購自碧云天生物技術有限公司)。

1.2 動物分組及PAN急性腎病模型建立 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組(C組)11只、模型組(M組)10只和干預組11只(E組)，后兩組均單次腹腔注射PAN(15 mg/100 g)制備PAN急性腎病模型，C組注射等體積生理鹽水。造模后第3天開始，E組予依普利酮10 mg/(100 g·d)灌胃，余兩組給予等量蒸餾水灌胃，均連續2周。

1.3 標本收集及相關指標檢測

1.3.1 24 h尿蛋白檢測 利用代謝籠收集大鼠每天尿液，采用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白定量。

1.3.2 血白蛋白(Alb)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TC)檢測 實驗結束后麻醉大鼠，剖腹，自心臟抽取血液標本3～5 mL，分離血清后保存于-80℃冰箱，采用全自動生化分析儀檢測Alb、Cr、BUN、TC。

1.3.3 腎組織病理學觀察 經心臟抽血完畢后，自左心室灌注生理鹽水，取右腎上極并去除包膜，1/3組織以4%多聚甲醛固定、石蠟切片，行PAS染色后400倍光鏡下觀察;1/3組織經固定、脫水、包埋、固化后切片染色，于電鏡下觀察;1/3組織置液氮冰凍保存。

1.3.4 腎小球足細胞標志物蛋白檢測 ①Nephrin蛋白表達:采用Western blotting法。取上述液氮保存的腎皮質組織100 mg，加入1 mL的RIPA+PMSF(100∶1)于冰上勻漿、裂解半小時，提取組織蛋白，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清用紫外分光光度計測蛋白濃度，按3∶1加入上樣緩沖液，100℃水浴10 min后于-80℃冰箱保存。取60 μg蛋白于SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜至PVDF膜，1%的BSA封閉2 h，TBST洗膜3次后加入一抗兔抗β-actin多克隆抗體(1∶500)、兔抗鼠 Nephrin 抗體(1∶400)，4℃孵育過夜;再次TBST洗膜3次后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)，室溫孵育2 h后洗膜，按ECL顯影劑說明書操作顯影。用目的蛋白灰度值與內參β-actin灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。②Nephrin mRNA表達:采用實時定量PCR法。取液氮保存腎臟組織50 mg，按高純度總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)說明書提取總RNA并用紫外分光光度計檢測260、280 nm處的吸光度(A)值，確定RNA的純度和量并將其逆轉錄為cDNA。PCR反應體系為20 μL，95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，40個循環;溶解曲線95℃ 15 s，60℃ 1 h，95℃ 15 s，60℃ 15 s。擴增完畢后，經PCR儀軟件系統處理擴增曲線，得到每一樣本循環閾值(CT值)，實驗重復3次。以GAPDH做為參照，用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。③Podocin和Podocalyxin蛋白表達:采用免疫熒光法。取液氮凍存腎臟組織，冰凍切片機切片、風干，室溫下用冷丙酮固定10 min，PBS沖洗2×3 min后滴加兔抗人Podocin抗體、兔抗鼠Podocalyxin抗體，室溫避光孵育40 min，同上PBS沖洗，緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，進行半定量評分，其中無色為0分、弱染色為1分、中等染色為2分、強染色為3分。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較用非配對t檢驗，三組間比較用單因素方差分析，有意義者用Scheffe's F檢驗對個體之間的差異進行重要性評估。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 24 h尿蛋白定量 實驗第7～14天，M組和E組24 h尿蛋白定量均顯著高于C組，但E組顯著低于M組。詳見表1。

表1 三組24 h尿蛋白定量比較(mg，±s)

表1 三組24 h尿蛋白定量比較(mg，±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.01;與 M 組比較，#P ＜0.05

組別 尿蛋白第7天 第14天24 h M 組 201.00 ±24.9* 376.00 ±34.70*E 組 174.00 ±22.5*# 124.00 ±25.80*#C組9.54 ± 5.63 18.00 ± 6.03

2.2 血清Alb、TC、BUN、CrM 組和 E組血清 Alb均顯著低于C組，BUN、Cr均顯著高于C組;M組TC明顯高于C組。詳見表2。

表2 三組血清 Alb、TC、BUN、Cr水平比較(±s)

表2 三組血清 Alb、TC、BUN、Cr水平比較(±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05，#P＜0.01

組別 Alb(g/L) TC(mmol/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)M 組 16.6 ±7.09# 2.72 ±0.07#7.48 ±0.84* 34.0 ±1.44*E 組 17.2 ±5.71# 1.74 ±0.03* 7.21 ±1.23* 26.4 ±0.65*C組31.8 ±4.33 1.78 ±0.04 6.40 ±0.66 20.5 ±1.03

2.3 腎臟組織病理表現 PAS染色顯示，M組大鼠未見慢性腎病的組織病理改變，腎小球基本正常，符合微小病變腎病(MCD)病理表現。電鏡檢查顯示，M組大鼠足突廣泛融合、消失，局部基底膜裸露;E組部分足突變短、超微結構改善，但融合仍多見。

2.4 Podocin、Podocalyxin蛋白表達 M 組和 E組Podocin和Podocalyxin蛋白表達明顯均低于C組，尤以M組為著。詳見表3。

表3 三組Podocin、Podocalyxin蛋白表達比較(分，±s)

表3 三組Podocin、Podocalyxin蛋白表達比較(分，±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 M 組比較，#P ＜0.05

組別 Podocin蛋白 Podocalyxin 蛋白M 組 1.00 ±0.66* 0.90 ±0.57*E 組 1.81 ±0.75*# 2.00 ±0.63*#C組3.00 ±0.00 3.00 ±0.00

2.5 Nephrin蛋白及mRNA表達 M組和E組Nephrin蛋白及mRNA表達均明顯低于C組，尤以M組為著。詳見表4。

表4 三組Nephrin蛋白及mRNA表達比較(±s)

表4 三組Nephrin蛋白及mRNA表達比較(±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 M 組比較，#P ＜0.05

組別 Nephrin蛋白Nephrin mRNA M 組 0.65 ±0.46* 0.47 ±0.04*E 組 0.84 ±0.39*# 0.53 ±0.03#C組0.96 ±0.32 0.97 ±0.09

3 討論

足細胞是腎小球過濾屏障的主要組成部分，其損傷可導致大量蛋白尿，而蛋白尿增加又與腎小球疾病的進展密切相關［1］。研究發現，許多毒物、抗體、補體因子和機械壓力等因素均能導致足細胞損傷;Mundel等認為足細胞損傷主要包括以下四方面:①裂孔隔膜蛋白復合物成分及結構的改變;②肌動蛋白細胞骨架結構破壞;③足細胞與腎小球基底膜組成成分及相互作用方式改變;④足細胞表面負電荷屏障受損。PAN腎病模型是目前較理想的模擬人類急性腎病綜合征的動物模型，其病理過程和臨床表現分別以足細胞損傷和大量蛋白尿為主。本研究通過給SD大鼠腹腔靜脈單次注射PAN建立MCD模型，結果實驗第7天大鼠尿蛋白顯著增加并持續至第14天，同時血清Alb水平顯著下降，TC、Cr明顯升高，與文獻報道一致，提示造模成功。此外，本研究M組光鏡下未見腎小球毛細血管袢肥大、系膜細胞增生、細胞外基質增多、基底膜增厚、腎小管擴張等慢性腎病的組織病理改變，符合MCD病理表現;電鏡下腎臟組織可見足突廣泛融合、消失，部分足細胞脫落，基底膜裸露。故上述模型蛋白尿程度與腎組織病理變化程度相符。

Nephrin與特異性脂筏在細胞膜的正常分布對于維持正確的信號通路非常重要。近年來有關腎小球濾過屏障的分子結構及其功能的研究［2］進展迅速，這些蛋白分子表達變化和(或)分子結構改變均可導致腎小球濾過屏障結構和功能異常。Podocin分布異常是足細胞損傷過程中的重要分子效應。有學者等［3］發現，Podocin分布異常與足細胞損傷密切相關，足細胞損傷早期Podocin即有改變。Podocalyxin是足細胞上最特異的標志蛋白、足細胞表面的主要組成成分，其可與其他蛋白在足細胞表面形成陰離子外衣，并通過電荷的相斥作用保持足突間的距離、控制足細胞裂孔的開放、維持腎小球囊腔的空間結構和功能。研究［4］表明，Podocalyxin可與多種足細胞蛋白以復合體形式調節足細胞和裂隙膜的結構。本研究顯示，實驗第14天M組Nephrin蛋白、mRNA表達及Podocin、Podocalyxin蛋白表達均較C組明顯下降。提示 Nephrin、Podocin、Podocalyxin表達與腎小球足細胞損傷有關。

后天性足細胞病(如原發性局灶性節段性腎小球硬化和MCD)目前被廣泛認為是免疫介導的疾病，常規免疫抑制劑常可產生多種毒副作用，患者治療依從性不高。近年來，MR拮抗劑對腎小球過濾屏障的作用逐漸得到重視［5］。Kang 等［6］發現，依普利酮和替米沙坦治療后大鼠尿蛋白排泄率和蛋白尿減少，且依普利酮對醛固酮導致的足細胞凋亡有保護作用。Nagase對基因敲除小鼠的研究提示，MR激動在慢性腎臟病的病理過程起關鍵作用，表現為蛋白尿、足細胞損傷和腎小球硬化;鹽皮質激素受體拮抗劑依普利酮可緩解非血清醛固酮濃度升高所致腎內MR信號通路表達增強。因此，MR可能經依賴醛固酮(經醛固酮釋放因子)和非依賴醛固酮途徑(通過GTPase Rac1通路)激活［7］。本研究發現，依普利酮干預可逆轉PAN腎病大鼠的足細胞形態及標記蛋白表達。可能機制為依普利酮具有下列作用:阻斷MR 信號，減輕醛固酮的細胞毒作用［8～10］;通過減輕腎小球的超濾作用［11，12］減輕高血壓患者的蛋白尿，對于合并糖尿病高血壓患者的腎臟保護作用更為明顯;在藥理濃度下不抑制腎上腺細胞對醛固酮和皮質醇的分泌［13，14］;通過改善脂質過氧化影響 SGK1 信號通路［15，16］。

綜上所述，依普利酮能夠明顯減少PAN腎病大鼠的尿蛋白，可能機制為上調足細胞標記蛋白表達和活性。

［1］Thomas MC.Pathogenesis and progression of proteinuria［J］.Contrib Nephrol，2011，170(1):48-56.

［2］王玉潔，曹靈，孫興旺.足細胞與蛋白尿發病機制的研究進展［J］.山東醫藥，2012，52(19):90-92.

［3］Rafiq K，Hitomi H，Nakano D，et al.Pathophysiological roles of aldosterone and mineralocorticoid receptor in the kidney［J］.J Pharmacol Sci，2011，115(1):1-7.

［4］ Ye P，Yamashita T，Pollock DM，et al.Contrasting effects of eplerenone and spironolactone on adrenal cell steroidogenesis［J］.Horm Metab Res，2009，41(1):35-39.

［5］Liang W，Chen C，Shi J，et al.Disparate effects of eplerenone，amlodipine and telmisartan on podocyte injury in aldosterone-infused rats［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(3):789-799.

［6］Kang YS，Ko GJ，Lee MH，et al.Effect of eplerenone，enalapril and their combination treatment on diabetic nephropathy in typeⅡdiabetic rats［J］.Nephrol Dial Transpl，2009，24(1):73.

［7］Kiyomoto H，Rafiq K，Mostofa M，et al.Possible underlying mechanisms responsible for aldosterone and mineralocorticoid receptor-dependent renal injury［J］.J Pharmacol Sci，2008，108(4):399-405.

［8］Fang Z，Zhang C，He F，et al.Protective effects of eplerenone on podocyte injury in adriamycin nephropathy rats［J］.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci，2011，31(3):329-334.

［9］Tesch GH.Review:serum and urine biomarkers of kidney disease:a pathophysiological perspective［J］.Nephrology(Carlton)，2010，15(6):609-616.

［10］Mathieson，PW.The podocyte as a target for therapies-new and old［J］.Nat Rev Nephrol，2012，8(1):52-56.

［11］Nagase M，Fujita T.Endocrinological aspects of proteinuria and podocytopathy in diabetes:role of the aldosterone/mineralocorticoid receptor system［J］.Curr Diabetes Rev，2011，7(1):8-16.

［12］Gao F，Maiti S，Sun G，et al.The Wt1+/R394W mouse displays glomerulosclerosis and early-onset renal failure characteristic of human Denys-Drash syndrome［J］.Mol Cell Biol，2004，24(22):9899-9910.

［13］Jain G，Campbell RC，Warnock DG.Mineralocorticoid receptor blockers and chronic kidney disease［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2009，4(10):1685-1691.

［14］Nagase M.Activation of the aldosterone/mineralocorticoid receptor system in chronic kidney disease and metabolic syndrome［J］.Clin Exp Nephrol，2010，14(4):303-314.

［15］Ahn JH，Hong HC，Cho MJ，et al.Effect of eplerenone，a selective aldosterone blocker，on the development of diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats［J］.Diabetes Metab J，2012，36(2):128-135.

［16］Lee MY，Shim MS，Kim BH，et al.Effects of spironolactone and losartan on diabetic nephropathy in a type 2 diabetic rat model［J］.Diabetes Metab J，2011，35(2):130-137.