水稻秸稈降解菌的篩選

畢春鵬等

摘要：為解決水稻秸稈還田的快速腐熟問題，通過剛果紅和半纖維素平板透明圈法的初篩和酶活力高低的復篩，從稻田土壤中分離篩選出纖維素降解菌X-5和半纖維素降解菌B-3，30 ℃條件下水稻秸稈7 d的降解率分別為27.4%和23.9%。

關鍵詞：水稻秸稈降解；纖維素；半纖維素；酶活

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0014-02

秸稈還田能夠增加土壤有機質，是土壤改良修復的有效措施之一，但我國北方秋冬季氣溫低，秸稈腐熟程度影響下季的生產[1]。采用微生物菌劑降解秸稈，促使秸稈高效還田，是解決該問題的有效方法之一[2]。本試驗從稻田土壤中篩選降解纖維素、半纖維素的菌株，為研制秸稈降解菌劑提供試驗菌株。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

取沈陽市東陵區稻田10～20 cm深的土壤存于密封袋，置于4 ℃條件下保存。

1.2 培養基

1.2.1 篩選纖維素分解菌培養基

1） 初篩鑒別培養基[3]：梭甲基纖維素鈉20.0 g，硫酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然。

2） 液體復篩培養基：60目稻稈粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，硫酸銨5.0 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.3 g，二水合氯化鈣0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 篩選半纖維素分解菌培養基

1） 半纖維素初篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，瓊脂20.0 g ，水1 000 mL，pH自然。

2） 液態復篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL，pH自然。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

稱取10 g土樣溶于90 mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min后靜置15 min。

2.2 纖維素降解菌的篩選

無菌操作，移取0.5 mL土樣上清液于初篩平板培養基上涂布，然后置于恒溫箱30 ℃倒置培養3～5 d，選取透明圈和菌落直徑比D/d值大的菌株進行劃線分離[4]。將初篩得到的單菌落制成菌懸液后，接種到液體復篩培養基中，并在恒溫振蕩器中30 ℃，130

r/min振蕩培養48 h。將發酵液以5 000 r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其纖維素酶的活性。

2.3 半纖維素降解菌的篩選

吸取土壤樣品上清液0.5 mL在初篩培養基上涂布，置于恒溫箱中30 ℃倒置培養3～5 d，挑取有水解圈的菌落轉接至固態復篩培養基[5]。菌落培養出后，各挑取一環分別接種到液態復篩培養基中，恒溫振蕩器30 ℃、130 r/min振蕩培養48 h，將發酵液以5 000

r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其半纖維素酶的活性[6]。

2.4 水稻秸稈降解試驗

準確稱量40目水稻秸稈粉5.0 g裝入250 mL三角瓶中，分別接種兩種菌液2.5 mL，30 ℃下發酵7 d，用無菌水沖洗離心，重復3次，棄去上清液，80 ℃烘干至恒重。發酵前后質量之差即為秸稈降解的質量。

3 結果與分析

3.1 纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到19株在羧甲基纖維素鈉剛果紅平板上有透明圈的菌株，其中D/d值大于2的有6株。將初篩得到的6株菌接種到液體產酶培養基中進行搖瓶培養3 d后測其酶活。菌落直徑與透明圈直徑值比及CMC酶活見表1，其中X-5酶活最高，為5.53 IU/g。X-5在剛果紅培養基上的透明圈見圖1。

3.2 半纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到5株在半纖維素初篩平板上有透明圈的菌株。對初篩得到的5株菌進行搖瓶發酵試驗，通過測定發酵液的木聚糖酶活力，進一步考查各菌株的產酶能力，結果見表2。由表2可知，B-3菌株產生的半纖維素酶活力明顯高于其他4株菌。圖2為菌株B-3在初篩平板上的透明圈。

3.3 水稻秸稈降解試驗

利用篩選出的兩株秸稈降解菌對水稻秸稈進行實際降解。在30 ℃條件下7 d后，利用菌株X-5降解的水稻秸稈質量減少了27.4%，利用菌株B-3降解的水稻秸稈質量減少了23.9%。這就表明篩選出的菌株的確對水稻秸稈有較好的降解效果。

4 討論

具有高產纖維素酶和半纖維素酶的菌株能提高水稻秸稈降解效率，促進秸稈還田。本試驗通過透明圈法篩選和酶活測定，得到秸稈降解菌株X-5和菌株B-3，并對水稻秸稈進行實際降解試驗，結果表明，在30 ℃條件下降解7 d，秸稈質量分別下降了27.4%和23.9%。接下來將對這兩株菌進行分類學鑒定，并對其產酶特性及酶學性質進行深入探究。

參考文獻

[1] 任俊莉，彭鋒，彭新文，等.農業秸稈半纖維素分離及純化技術研究進展[J].纖維素科學與技術，2010，18（3）：56-68.

[2] Robson LM，Chambliss GH.Cellulases of bacterial origin[J].Enzyme Microbiotechnology，1989（11）：626-644.

[3] 陳燕，周孫全，鄭奇士，等.常溫纖維素降解菌的分離與鑒定[J].上海交通大學學報，微生物學雜志，2005，25（3）：57-61.

[4] 郝月，楊翔華，張晶，等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選.[J].農業生物技術科學，2005，21（7）：58-60.

[5] 萬先凱.一株高活力纖維素分解菌的篩選及酶學性質研究[D].天津：天津大學，2004.

[6] 董國強，張孟白，林開江.半纖維素酶的DNS液顯色法測定[J].浙江農業科學，1989（2）：88-89.

摘要：為解決水稻秸稈還田的快速腐熟問題，通過剛果紅和半纖維素平板透明圈法的初篩和酶活力高低的復篩，從稻田土壤中分離篩選出纖維素降解菌X-5和半纖維素降解菌B-3，30 ℃條件下水稻秸稈7 d的降解率分別為27.4%和23.9%。

關鍵詞：水稻秸稈降解；纖維素；半纖維素；酶活

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0014-02

秸稈還田能夠增加土壤有機質，是土壤改良修復的有效措施之一，但我國北方秋冬季氣溫低，秸稈腐熟程度影響下季的生產[1]。采用微生物菌劑降解秸稈，促使秸稈高效還田，是解決該問題的有效方法之一[2]。本試驗從稻田土壤中篩選降解纖維素、半纖維素的菌株，為研制秸稈降解菌劑提供試驗菌株。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

取沈陽市東陵區稻田10～20 cm深的土壤存于密封袋，置于4 ℃條件下保存。

1.2 培養基

1.2.1 篩選纖維素分解菌培養基

1） 初篩鑒別培養基[3]：梭甲基纖維素鈉20.0 g，硫酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然。

2） 液體復篩培養基：60目稻稈粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，硫酸銨5.0 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.3 g，二水合氯化鈣0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 篩選半纖維素分解菌培養基

1） 半纖維素初篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，瓊脂20.0 g ，水1 000 mL，pH自然。

2） 液態復篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL，pH自然。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

稱取10 g土樣溶于90 mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min后靜置15 min。

2.2 纖維素降解菌的篩選

無菌操作，移取0.5 mL土樣上清液于初篩平板培養基上涂布，然后置于恒溫箱30 ℃倒置培養3～5 d，選取透明圈和菌落直徑比D/d值大的菌株進行劃線分離[4]。將初篩得到的單菌落制成菌懸液后，接種到液體復篩培養基中，并在恒溫振蕩器中30 ℃，130

r/min振蕩培養48 h。將發酵液以5 000 r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其纖維素酶的活性。

2.3 半纖維素降解菌的篩選

吸取土壤樣品上清液0.5 mL在初篩培養基上涂布，置于恒溫箱中30 ℃倒置培養3～5 d，挑取有水解圈的菌落轉接至固態復篩培養基[5]。菌落培養出后，各挑取一環分別接種到液態復篩培養基中，恒溫振蕩器30 ℃、130 r/min振蕩培養48 h，將發酵液以5 000

r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其半纖維素酶的活性[6]。

2.4 水稻秸稈降解試驗

準確稱量40目水稻秸稈粉5.0 g裝入250 mL三角瓶中，分別接種兩種菌液2.5 mL，30 ℃下發酵7 d，用無菌水沖洗離心，重復3次，棄去上清液，80 ℃烘干至恒重。發酵前后質量之差即為秸稈降解的質量。

3 結果與分析

3.1 纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到19株在羧甲基纖維素鈉剛果紅平板上有透明圈的菌株，其中D/d值大于2的有6株。將初篩得到的6株菌接種到液體產酶培養基中進行搖瓶培養3 d后測其酶活。菌落直徑與透明圈直徑值比及CMC酶活見表1，其中X-5酶活最高，為5.53 IU/g。X-5在剛果紅培養基上的透明圈見圖1。

3.2 半纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到5株在半纖維素初篩平板上有透明圈的菌株。對初篩得到的5株菌進行搖瓶發酵試驗，通過測定發酵液的木聚糖酶活力，進一步考查各菌株的產酶能力，結果見表2。由表2可知，B-3菌株產生的半纖維素酶活力明顯高于其他4株菌。圖2為菌株B-3在初篩平板上的透明圈。

3.3 水稻秸稈降解試驗

利用篩選出的兩株秸稈降解菌對水稻秸稈進行實際降解。在30 ℃條件下7 d后，利用菌株X-5降解的水稻秸稈質量減少了27.4%，利用菌株B-3降解的水稻秸稈質量減少了23.9%。這就表明篩選出的菌株的確對水稻秸稈有較好的降解效果。

4 討論

具有高產纖維素酶和半纖維素酶的菌株能提高水稻秸稈降解效率，促進秸稈還田。本試驗通過透明圈法篩選和酶活測定，得到秸稈降解菌株X-5和菌株B-3，并對水稻秸稈進行實際降解試驗，結果表明，在30 ℃條件下降解7 d，秸稈質量分別下降了27.4%和23.9%。接下來將對這兩株菌進行分類學鑒定，并對其產酶特性及酶學性質進行深入探究。

參考文獻

[1] 任俊莉，彭鋒，彭新文，等.農業秸稈半纖維素分離及純化技術研究進展[J].纖維素科學與技術，2010，18（3）：56-68.

[2] Robson LM，Chambliss GH.Cellulases of bacterial origin[J].Enzyme Microbiotechnology，1989（11）：626-644.

[3] 陳燕，周孫全，鄭奇士，等.常溫纖維素降解菌的分離與鑒定[J].上海交通大學學報，微生物學雜志，2005，25（3）：57-61.

[4] 郝月，楊翔華，張晶，等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選.[J].農業生物技術科學，2005，21（7）：58-60.

[5] 萬先凱.一株高活力纖維素分解菌的篩選及酶學性質研究[D].天津：天津大學，2004.

[6] 董國強，張孟白，林開江.半纖維素酶的DNS液顯色法測定[J].浙江農業科學，1989（2）：88-89.

摘要：為解決水稻秸稈還田的快速腐熟問題，通過剛果紅和半纖維素平板透明圈法的初篩和酶活力高低的復篩，從稻田土壤中分離篩選出纖維素降解菌X-5和半纖維素降解菌B-3，30 ℃條件下水稻秸稈7 d的降解率分別為27.4%和23.9%。

關鍵詞：水稻秸稈降解；纖維素；半纖維素；酶活

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0014-02

秸稈還田能夠增加土壤有機質，是土壤改良修復的有效措施之一，但我國北方秋冬季氣溫低，秸稈腐熟程度影響下季的生產[1]。采用微生物菌劑降解秸稈，促使秸稈高效還田，是解決該問題的有效方法之一[2]。本試驗從稻田土壤中篩選降解纖維素、半纖維素的菌株，為研制秸稈降解菌劑提供試驗菌株。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

取沈陽市東陵區稻田10～20 cm深的土壤存于密封袋，置于4 ℃條件下保存。

1.2 培養基

1.2.1 篩選纖維素分解菌培養基

1） 初篩鑒別培養基[3]：梭甲基纖維素鈉20.0 g，硫酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.4 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH自然。

2） 液體復篩培養基：60目稻稈粉10.0 g，蛋白胨5.0 g，硫酸銨5.0 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.3 g，二水合氯化鈣0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 篩選半纖維素分解菌培養基

1） 半纖維素初篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，瓊脂20.0 g ，水1 000 mL，pH自然。

2） 液態復篩培養基：半纖維素20.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL，pH自然。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

稱取10 g土樣溶于90 mL帶玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min后靜置15 min。

2.2 纖維素降解菌的篩選

無菌操作，移取0.5 mL土樣上清液于初篩平板培養基上涂布，然后置于恒溫箱30 ℃倒置培養3～5 d，選取透明圈和菌落直徑比D/d值大的菌株進行劃線分離[4]。將初篩得到的單菌落制成菌懸液后，接種到液體復篩培養基中，并在恒溫振蕩器中30 ℃，130

r/min振蕩培養48 h。將發酵液以5 000 r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其纖維素酶的活性。

2.3 半纖維素降解菌的篩選

吸取土壤樣品上清液0.5 mL在初篩培養基上涂布，置于恒溫箱中30 ℃倒置培養3～5 d，挑取有水解圈的菌落轉接至固態復篩培養基[5]。菌落培養出后，各挑取一環分別接種到液態復篩培養基中，恒溫振蕩器30 ℃、130 r/min振蕩培養48 h，將發酵液以5 000

r/min離心20 min，得粗酶液，采用DNS法測其半纖維素酶的活性[6]。

2.4 水稻秸稈降解試驗

準確稱量40目水稻秸稈粉5.0 g裝入250 mL三角瓶中，分別接種兩種菌液2.5 mL，30 ℃下發酵7 d，用無菌水沖洗離心，重復3次，棄去上清液，80 ℃烘干至恒重。發酵前后質量之差即為秸稈降解的質量。

3 結果與分析

3.1 纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到19株在羧甲基纖維素鈉剛果紅平板上有透明圈的菌株，其中D/d值大于2的有6株。將初篩得到的6株菌接種到液體產酶培養基中進行搖瓶培養3 d后測其酶活。菌落直徑與透明圈直徑值比及CMC酶活見表1，其中X-5酶活最高，為5.53 IU/g。X-5在剛果紅培養基上的透明圈見圖1。

3.2 半纖維素降解菌的篩選結果

經過常溫分離篩選，得到5株在半纖維素初篩平板上有透明圈的菌株。對初篩得到的5株菌進行搖瓶發酵試驗，通過測定發酵液的木聚糖酶活力，進一步考查各菌株的產酶能力，結果見表2。由表2可知，B-3菌株產生的半纖維素酶活力明顯高于其他4株菌。圖2為菌株B-3在初篩平板上的透明圈。

3.3 水稻秸稈降解試驗

利用篩選出的兩株秸稈降解菌對水稻秸稈進行實際降解。在30 ℃條件下7 d后，利用菌株X-5降解的水稻秸稈質量減少了27.4%，利用菌株B-3降解的水稻秸稈質量減少了23.9%。這就表明篩選出的菌株的確對水稻秸稈有較好的降解效果。

4 討論

具有高產纖維素酶和半纖維素酶的菌株能提高水稻秸稈降解效率，促進秸稈還田。本試驗通過透明圈法篩選和酶活測定，得到秸稈降解菌株X-5和菌株B-3，并對水稻秸稈進行實際降解試驗，結果表明，在30 ℃條件下降解7 d，秸稈質量分別下降了27.4%和23.9%。接下來將對這兩株菌進行分類學鑒定，并對其產酶特性及酶學性質進行深入探究。

參考文獻

[1] 任俊莉，彭鋒，彭新文，等.農業秸稈半纖維素分離及純化技術研究進展[J].纖維素科學與技術，2010，18（3）：56-68.

[2] Robson LM，Chambliss GH.Cellulases of bacterial origin[J].Enzyme Microbiotechnology，1989（11）：626-644.

[3] 陳燕，周孫全，鄭奇士，等.常溫纖維素降解菌的分離與鑒定[J].上海交通大學學報，微生物學雜志，2005，25（3）：57-61.

[4] 郝月，楊翔華，張晶，等.秸稈纖維素分解菌的分離篩選.[J].農業生物技術科學，2005，21（7）：58-60.

[5] 萬先凱.一株高活力纖維素分解菌的篩選及酶學性質研究[D].天津：天津大學，2004.

[6] 董國強，張孟白，林開江.半纖維素酶的DNS液顯色法測定[J].浙江農業科學，1989（2）：88-89.