納豆芽孢桿菌發酵液體外溶栓效果試驗

孫軍德等

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應底物，觀察各反應物的溶栓效果。試驗結果表明：納豆激酶發酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農業大學土地與環境學院微生物學實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養皿中，蓋上培養皿蓋，在37 ℃條件下孵育數小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發酵液和液體培養基中，37 ℃水浴反應4 h，每30 min震蕩1次。反應結束后用反應液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應后血塊質量，計算血塊溶解率。

2 結果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發現，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數小時，觀察發現人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產的胞外溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結果顯示，濃縮發酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產的溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學性質研究[J].微生物學通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學性質[J].食品科學，2012，33（15）：231-234.

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應底物，觀察各反應物的溶栓效果。試驗結果表明：納豆激酶發酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農業大學土地與環境學院微生物學實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養皿中，蓋上培養皿蓋，在37 ℃條件下孵育數小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發酵液和液體培養基中，37 ℃水浴反應4 h，每30 min震蕩1次。反應結束后用反應液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應后血塊質量，計算血塊溶解率。

2 結果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發現，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數小時，觀察發現人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產的胞外溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結果顯示，濃縮發酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產的溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學性質研究[J].微生物學通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學性質[J].食品科學，2012，33（15）：231-234.

摘要：納豆激酶是納豆芽孢桿菌的重要代謝產物。為探究納豆激酶的溶栓效果，以納豆浸提液、納豆激酶發酵液為供試材料，以雞血塊、人工血栓為供試反應底物，觀察各反應物的溶栓效果。試驗結果表明：納豆激酶發酵液、納豆浸提液有溶解人工血栓的作用；納豆激酶發酵液和納豆浸提液對雞血塊的溶解率分別為60%和52%。

關鍵詞：納豆芽孢桿菌；納豆激酶發酵液；體外溶栓

中圖分類號：S154.39 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）06-0010-02

納豆原名豆豉，1754年由鑒真法師東渡弘法帶到日本。納豆激酶是一種具有強烈溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，是納豆發酵過程中由納豆芽孢桿菌分泌產生的[1-3]。與其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、無任何毒副作用等優勢[4]，被廣泛用于心腦血管疾病的預防。近年來，東南亞民間盛傳 “吃納豆預防血栓”“吃納豆能長壽”。納豆在我國也逐漸受到人們的青睞。通過體外溶栓試驗分析比較納豆浸提液和納豆芽孢桿菌發酵液的溶栓效果，旨在為納豆激酶溶栓特性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種 自行篩選得到1株納豆芽孢桿菌，保存于沈陽農業大學土地與環境學院微生物學實驗室。

1.1.2 試劑藥品 牛纖維蛋白原和凝血酶購自遼寧省藥品檢驗所，其他藥品均購自國藥集團。液體培養基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。

1.1.3 人工血栓的制備 將10 mg牛纖維蛋白原溶于1 mL無菌生理鹽水中，加入1 Bp凝血酶迅速混勻，37 ℃水浴靜置10 min，凝固形成人工血栓。

1.1.4 納豆浸提液的制備 取自制納豆2粒于10 mL無菌生理鹽水中，充分震蕩，該溶液即為納豆浸提液。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮發酵液的提取 采用多次凍融法，將納豆芽孢桿菌發酵液在4 ℃，8 000 r/min下離心30 min，去除菌體；將上清液在-20 ℃冰箱中冷凍至完全固化，再在室溫下自然解凍，解凍至約有70%液體融化時，保存液體于-20 ℃冰箱中。重復此步驟，最終獲得的液體即為濃縮發酵液。

1.2.2 體外溶解人工血栓效果試驗 將10 mL納豆浸提液倒入裝有制備好的人工血栓培養皿中，蓋上培養皿蓋，在37 ℃條件下孵育數小時；用10 mL無菌生理鹽水做空白試驗，觀察兩組人工血栓的溶解情況。

1.2.3 血塊溶解率的計算 新鮮雞血在空氣中自然凝固后切成小塊，30 ℃烘干至恒重。每組取血塊2塊，稱重記為m0，分別放入10 mL納豆浸提液、0.9%無菌生理鹽水、納豆激酶濃縮發酵液和液體培養基中，37 ℃水浴反應4 h，每30 min震蕩1次。反應結束后用反應液沖洗血塊，30 ℃烘干至恒重，稱量反應后血塊質量，計算血塊溶解率。

2 結果與分析

2.1 體外溶解人工血栓

試驗發現，浸泡在納豆浸提液中的人工血栓體積明顯減小，而浸泡在生理鹽水中的人工血栓塊體積幾乎無變化，這說明納豆浸提液中確實含有能夠溶解血栓的有效成分，且效果較為顯著。

將濃縮納豆激酶發酵液倒入裝有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育數小時，觀察發現人工血栓幾乎完全溶解。

2.2 體外溶解血塊

不同溶液對雞血塊的溶解效果如表1所示。用多次凍融法得到的濃縮納豆激酶發酵液的溶血塊效果最為明顯，可達到60%；納豆浸提液的效果次之，可達到52%。這都遠遠大于兩個空白組，說明納豆芽孢桿菌所產的胞外溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較強的溶栓能力。

3 結論

1） 從體外溶解人工血栓的試驗效果可以看出，納豆浸提液與用多次凍融法提取的納豆激酶發酵液均可以溶解人工血栓，且納豆激酶發酵液溶解人工血栓的作用強于納豆浸提液。

2） 從體外溶解血塊的試驗可以得出，納豆激酶發酵液的溶血塊效果較為明顯，溶解率達到60%；納豆浸提液的溶解率為52%，均遠大于兩個空白組。

3） 試驗結果顯示，濃縮發酵液對人工血栓和血塊的溶解效果均大于納豆浸提液，這說明納豆芽孢桿菌產的溶解血栓的有效物質——納豆激酶具有比較明顯的溶解血栓能力，且濃度越大效果越強。

參考文獻

[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.

[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.

[3] 朱健輝，杜連祥，路福平，等.高效溶栓酶——納豆激酶的純化及酶學性質研究[J].微生物學通報，2006，33（1）：68-71.

[4] 王剛，郭明珠，陳光.枯草芽孢桿菌納豆激酶分離純化及酶學性質[J].食品科學，2012，33（15）：231-234.