柏大蚜蜜露中可培養細菌的季節變化動態

王鴻艷，南小寧，王云果，魏 琮，賀 虹*

(1.西北農林科技大學林學院，陜西楊陵 712100;2.西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊陵 712100)

蚜蟲是典型的植食性昆蟲，是農林業主要的刺吸性害蟲之一，它不僅通過吸食樹木的汁液影響其生長，而且其排泄的蜜露可誘發煤污病和其他林木病害，對農作物和林木的生長環境造成很大的危害。同時，蚜蟲分泌的蜜露中含有豐富的糖類、氨基酸等碳水化合物，是自然界中螞蟻的重要食物資源 (Buckley，1987;Fischer et al.，2002)，也被一些天敵昆蟲如瓢蟲、小蜂等利用進行補充營養，并成為這些天敵昆蟲搜尋寄主的信息物質(陸宴輝等，2005)。Leroy et al.(2011)的研究進一步發現蜜露中特殊的微生物揮發出的信息物質能引誘和增加天敵昆蟲對蚜蟲的寄生效率。此外，蚜蟲體內普遍存在內共生細菌Buchnera和次級內共生菌(secondary symbionts) (Douglas，1998;Haynes et al.，2003;Baumann，2005)，這些細菌是否也有可能存在于蜜露中，然后隨之傳播到其他取食蜜露的昆蟲體內?因此，為了了解蚜蟲蜜露中微生物的分布情況，作者以柏大蚜Cinara tujafilina (del Guercio)為例，連續收集了7個月的蜜露樣品，采用微生物分離培養與16S rRNA 基因片段測序相結合的手段，進行了柏大蚜蜜露中細菌的種類組成和多樣性研究，并初步探討了這些細菌可能的來源和功能。

1 材料與方法

1.1 柏大蚜蜜露的采集

分別于2011年7-10月和2012年4-6月，于陜西楊凌西北農林科技大學校園內側柏林中，利用高枝剪剪取側柏枝條，檢查其上柏大蚜的分布狀況，并將感染有柏大蚜的側柏枝條帶回室內養蟲室。首先，利用毛筆先將枝條上的柏大蚜移入滅菌的培養皿中;然后將側柏枝條先用自來水沖洗，然后再浸于滅菌水中沖洗三遍，盡量清洗干凈枝條上的灰塵，晾干水分后將側柏枝條插入盛有無菌水的三角瓶中，重新將柏大蚜接于枝條上;三角瓶口外圍套上20 cm×20 cm的滅菌鋁箔紙，使蜜露掉落其上，然后用滅菌的大頭針和小槍頭吸取蜜露置于1.5 mL 離心管中(預先稱重)，根據蜜露量連續收集2-3 d，稱重后直接稀釋用于細菌培養。養蟲室提前經過消毒處理，減少室內空氣中微生物的影響。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜜露細菌的分離培養及純化

每月將收集的0.05 g 新鮮蜜露用500μL 無菌水稀釋成原液，并按幾何梯度稀釋至10-8。取原液、不同梯度稀釋液各100μL 涂布接種于LB 培養基平板上，各梯度分別做3個重復，用無菌水涂布3個平板，作為陰性對照。同時每天將3個干凈的LB 培養基平板置于收集蚜蟲蜜露樣品處，暴露于空氣中5 min，作為陽性對照以檢測實驗室空氣中存在的細菌。將所有接種和空氣對照的平板倒置于恒溫培養箱(28℃±1℃)中，培養48 h，選取菌落數在30-300個之間、無蔓延菌落生長的平板進行菌落計數。通過肉眼觀察比較菌落形態特征(包括菌落形狀、大小、色澤、光澤、濕潤度、透明度、隆起狀況、邊緣狀況、表面狀況等)，初步確定不同的細菌種類后，進行劃線培養，分離純化。使用固體斜面培養基對不同菌種進行劃線培養，置于4℃保存。

1.2.2 菌落PCR

分別挑取分離純化的細菌單菌落，用10μL的無菌水稀釋成菌懸液作為模板，以16S rRNA 基因通用引物27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R (5'-ATGGGYTACCTTGTTACG ACTT-3')進 行PCR 擴 增 (Weisburg et al.，1991)。PCR 反應體系包括:TaKaRa Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5μL，10×PCR 反應液(Mg2+free)2.5μL，dNTP 混合液 (2.5 mM)2μL，MgCl2(25 mM)1.5μL，引物(10μM)各1μL，模板2μL，用滅菌ddH2O 補足25μL。反應程序包括:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，進行25個循環;最后72℃延伸7 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，當達到測序的濃度和純度后送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。每種形態的菌落至少挑取2個進行測序分析。

對于不能擴增出PCR 產物以及PCR 產物無法滿足測序要求的菌株，通過嘗試以下3 種方法進行多次試驗至獲得可用的PCR 產物:(1)將菌懸液煮沸后作為模板進行PCR 擴增;(2)多次劃線培養，挑取單菌落重新制成菌懸液作為模板，進行PCR 擴增;(3)挑取單菌落置于LB 液體培養基中，28℃、220 rpm 振蕩培養過夜，菌液經3-5次反復凍融后，用細菌基因組DNA 試劑盒提取DNA，作為模板進行PCR 擴增。擴增體系和反應程序如上所述。

1.3 數據處理及分析

1.3.1 序列的處理及系統發育分析

利用軟件ChromasPro 1.5 和Lasergene 7 對原始序列進行拼接和校對，并切除首尾亂序。將校對后的序列在GenBank NCBI 數據庫中進行Blast比對并下載同源性最高的序列，整理后的序列在ClustalX 2.1 軟件(Larkin et al.，2007)中進行多重比對，比對結果在MEGA 5.05 (Tamura et al.，2011)中檢測出最理想的建樹模型，然后構建最大似然系統發育樹(Maxium Likelihood)，并結合Ribosomal Database Project 數據庫 (http://rdp.cme.msu.edu/)確定細菌的分類地位，依據細菌97%的序列相似性作為判定種類的標準。本研究分離得到的細菌16S rRNA 基因序列已經全部上傳 GenBank，序列號分別為 KC170346-KC170365 (7月份蜜露樣品)和KC810822-KC810841 (其他月份)。

1.3.2 細菌群落結構分析

采用α 多樣性指數(Hill et al.，2003)分析柏大蚜蜜露中可培養細菌的群落結構。

Shannon-Wiener 指數的計算公式為:

式中:S為一個樣品中可培養細菌屬水平上的總數;ni為第i個屬的細菌菌落數;N為可培養細菌菌落總數。

Simpson 指數的計算公式為:

均勻度(Evenness)指數的計算公式為:

Margalef 物種豐富度指數的計算公式為:

2 結果與分析

2.1 柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的數量變化

柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌數量及變化趨勢如圖1 所示。采用稀釋平板法計算出蜜露樣品中可培養細菌數量變化范圍為7.9× 102-4.9×105CFU/g，跨3個數量級，變化幅度較大，平均值為9.04×104CFU/g。蜜露樣品中的細菌數量在2011年7月達到最大值，8月蜜露樣品中的細菌數量大幅降低，9月又出現一個小高峰;2012年4-6月蜜露樣品中的細菌數量整體處于較低水平，6月數量最低。

圖1 不同月份柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的數量變化Fig.1 Quantity change of culturable bacteria in honeydew samples of Cinara tujafilina

2.2 柏大蚜蜜露中可培養細菌的種類組成

從7個月的蜜露樣品中，共分離到73個菌落表型差異的菌株，對其16S rRNA 基因序列的NCBI比對結果顯示這些菌株隸屬于4 門25 屬的細菌(表1)。其中，21.9% (16/73)的菌株為芽孢桿菌屬Bacillus 細菌，13.7% (10/73)菌株為不動桿菌屬Acinetobacter。此外，2011年8月的蜜露樣品中細菌種類最多，包括10個屬的細菌，2012年5月的蜜露樣品中細菌種類最少，僅包括3個屬的細菌。其中在柏大蚜蜜露樣品中發現的庫克菌屬Kocuria、壤球菌 屬 Agrococcus、微球菌 屬Micrococcus 和短小桿菌屬Curtobacterium 在空氣對照中也檢測到。

就菌落數量而言，柏大蚜蜜露中可培養細菌的優勢菌群隨著蜜露采集季節的變化而發生變化(表1)。2011年7月，優勢菌群為土壤桿菌Agrobacterium 和不動桿菌Acinetobacter，分別占該月 總菌落數的 36.1% (13/36) 和 30.6%(11/36);8月為土壤桿菌Agrobacterium 和莫拉氏菌Moraxella，分別占70% (91/130)和15.4%(20/130);9月為短小桿菌Curtobacterium，占97.1%(331/341);10月為葡萄球菌Staphylococcus，占50% (6/12);2012年4月，優勢菌群為短小桿菌Curtobacterium 和芽孢桿菌Bacillus，分別占67% (506/755)和31.4% (237/755);5月為節細菌Arthrobacter 和芽孢桿菌Bacillus，分別占53.9% (41/76)和44.7%(34/76);6月為細桿菌Microbacterium，占61.1% (11/18)。其中，土壤桿菌Agrobacterium、短小桿菌Curtobacterium 和芽孢桿菌Bacillus的細菌在不同月份的蜜露樣品中都表現出明顯的數量優勢。說明柏大蚜蜜露樣品中細菌種類隨著時間和外界的條件而發生變化。

就各屬細菌在不同蜜露樣品中的分布而言，芽孢桿菌屬Bacillus 細菌在蜜露樣品中最常出現，在4個月的樣品中都有發現;其次為鏈霉菌Streptomyces、短小桿菌Curtobacterium、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas 和不動桿菌Acinetobacter 在3個月的樣品中都有發現。

2.3 柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的多樣性分析

不同月份柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的多樣性指數見表2。Shannon-Wiener 指數(H')大小為7月＞10月＞6月＞8月＞5月＞4月＞9月，Simpson 指數(D)大小為7月＞10月＞6月＞5月＞8月＞4月＞9月，表明2011年7月、10月和6月的蜜露樣品中的可培養細菌多樣性較高，2012年4月和2011年9月的可培養細菌多樣性較低。從Evenness 指數(E)指數可以看出，10月＞7月＞6月＞5月＞8月＞4月＞9月，表明2011年10月蜜露樣品中的可培養細菌種類分布最均勻。就Margalef 物種豐富度(dMa)來看，7月＞8月＞6月＞10月＞9月＞4月＞5月，2011年7月蜜露樣品中的細菌種群類多，物種最豐富。

總之，由豐富度和細菌種類的不均勻性共同導致多樣性的高低起伏變化。2011年夏秋季節蜜露樣品中可培養細菌多樣性變化的規律性不明顯而且波動幅度較大，多樣性指數H' 和D的大小分別為:7月＞10月＞8月＞9月。2012年采集的3個樣品(4月、5月和6月)中細菌多樣性指數波動幅度相對較小，多樣性水平隨時間的推移而逐漸升高。

表2 柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的物種多樣性Table 2 Species diversity of bacterial strains in honeydew samples of Cinara tujafilina

2.4 柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的系統發育分析

從7個月的蜜露樣品中，共分離到73個菌落表型差異的菌株，序列相似性比對結果表明這些菌株分屬于25個屬的細菌。選取代表菌株的序列和從Genbank 中下載的與其最相似的序列構建了最大似然ML 系統發育樹(圖3)。從ML 系統樹中可以看出，所有菌株構成6個分支。變形菌門Proteobacteria的細菌比重最大，占 71.2%(52/73)，又分為3個分支:其中α-變形菌綱Alphaproteobacteria 和 γ-變形菌 綱Gammaproteobacteria 分別占23.3% (17/73)，各含6個屬，β-變形菌綱Betaproteobacteria 分支中僅包含代爾夫特菌屬Delftia的1 株細菌。變形菌門的細菌主要集中在2011年7月和8月收集的蜜露樣品中，占變形菌門所有細菌的86.5%(45/52)。厚壁菌門Firmicutes 占27.4%(20/73)，包括5個屬。放線菌門Actinobacteria 分支占23.3%(17/73)，包含6個屬。此外，擬桿菌門Bacteroidetes的黃桿菌Flavobacterium 形成一個單獨分支。

圖3 柏大蚜蜜露樣品可培養細菌的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis for 16S rRNA sequences of cultured bacteria in honeydew samples of Cinara tujafilina

3 結論與討論

蚜蟲蜜露中細菌數量在不同月份表現出明顯差異，這可能與蚜蟲及其寄主植物所處的溫濕度條件有關(表3)。蜜露樣品中細菌數量在2011年7月達到最大值，可能是由于當時氣溫較高、濕度較大，蚜蟲營養條件適合，同時也適合細菌的繁殖;8月高溫干旱，來源于植物內生菌的數量可能降低;進入10月，溫度降低，不適合于細菌繁殖;2012年6月與2011年8月氣候條件相似，高溫干旱可能導致植物內生菌的數量降低，從而間接影響了蜜露細菌的數量。

表3 蜜露收集月份的氣象統計數據Table 3 Weather statistics of honeydew collected months

柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的多樣性變化動態也與采樣季節密切相關，總體來說，由于2011年夏秋蜜露樣品中細菌的多樣性變化的規律性不明顯而且波動幅度大，多樣性指數為7月＞10月＞8月＞9月;在2012年春季4月、5月和6月收集的3個蜜露樣品中，細菌多樣性指數變化幅度也相對較小，且隨時間的推移而逐漸升高。

本研究從2011年7-10月和2012年4-6月共7個月所收集的柏大蚜蜜露樣品中共分離出25個屬的細菌。對于柏大蚜蜜露細菌種類的組成而言，不同月份收集的蜜露樣品中細菌種類、優勢菌種、群落結構都有很大差異。

無論在菌落數量、還是菌株數量季節分布來看，芽孢桿菌Bacillus 都是柏大蚜蜜露樣品中可培養細菌的優勢類群。芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧生活的革蘭氏陽性細菌，營養要求不高，生活能力強，該菌在不利的環境中可以形成芽孢將自己保護起來，復活率高，因而在自然界中廣泛分布于土壤、空氣等環境(于雅瓊等，2007)。此外，芽孢桿菌屬的細菌也是馬尾松(歐陽革成和張潤杰，2005)、鵝掌楸(夏杰等，2009)、銀杏(朱士茂，2011)等多種植物的內生菌，并在多種昆蟲體內也發現有該屬細菌的存在，如桑肩星天牛 Apriona germari (張偉等，2004)、黃粉蟲Tenebrio molitor (張麗等，2006)、豆天蛾Clanis bilineata tsingtauica 幼蟲(呂飛等，2009)、甘薯粉虱Bemesia tabaci (Ateyyat et al.，2010)、桔二叉蚜Toxoptera aurantii (Sevim et al.，2012)等，但尚未有報道指出芽孢桿菌屬的細菌存在于側柏或柏大蚜體內。芽孢桿菌能夠分泌脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶等多種微生物酶，因而能夠降解甘油三酯、淀粉、蛋白質、木聚糖、果膠等高分子物質，尤其對植物性的碳水化合物具有較強的降解能力(于雅瓊等，2007)。柏大蚜取食的是側柏枝條韌皮部和木質部中的汁液，它會將植物汁液中多余的碳水化合物排出體外而形成蜜露，該屬細菌對蜜露中的碳水化合物可能同樣具有降解作用。

短小桿菌屬Curtobacterium的細菌在2011年9月、10月及2012年4月的柏大蚜蜜露樣品中均有發現，并且在9月和4月的蜜露樣品中該屬細菌在菌落數量上都占有較大優勢(表1)，其菌落數加起來占所有可培養細菌菌落總數的61.3%(838/1368)。短小桿菌常出現于植物、土壤和油田，其中萎蔫短小桿菌C.flaccumfaciens 是常見的植物致病菌(車秀珠和蔡妙英，2001)。短小桿菌屬在柑橘罹病植株(李顏方等，2011)、黃瓜初花期葉片(孫占斌等，2012)中都是優勢的內生菌群。在黑粉蟲Tenebrio obscurus 和黃粉蟲T.molitor(張麗等，2006)、六斑異瓢蟲Aiolocaria mirabilis(孟祥杰等，2008)、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis (賀新華等，2010)的腸道中也有發現。本次分離到的短小桿菌屬細菌可能源于側柏或蚜蟲體內。

不動桿菌Acinetobacter 在2011年7月、10月及2012年4月的柏大蚜蜜露樣品中都有發現，且是7月蜜露樣品中的優勢菌之一。該屬中的乙酸鈣不動桿菌 A.calcoaceticus 曾在豌豆蚜Acyythosiphon pisum 蜜露中分離到(Leroy et al.，2011)。蜜露中的其他細菌在自然界中也很普遍，如，根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens 被列為十大細菌性植物病原菌之一，它能引起冠癭病(Mansfield et al.，2012);鞘氨醇單胞菌Sphingomonas 也在自然界中廣泛分布，已經從多種水陸環境中得到分離，并在昆蟲腸道中也有發現(Wenzel et al.，2002)。總之，這些從蜜露中分離到的細菌是否廣泛存在于其他蚜蟲蜜露中，對于蜜露的降解以及其他生物尤其是天敵昆蟲的影響有待于進一步的研究。

在野外收集蜜露比較困難，因此我們選擇在室內進行蜜露收集。在蜜露收集過程中進行實驗室消毒、采集工具高壓滅菌處理，對于蚜蟲所取食的側柏枝條也用無菌水多次沖洗，盡量排除實驗室人為污染。同時，作者認為蚜蟲寄主植物微生物對蜜露的組成所構成的“污染”也是蜜露細菌組成的一個合理部分，因為在野外蚜蟲蜜露也會受到來源于空氣、蚜蟲寄主植物及蚜蟲體表微生物的污染。此外，也不能排除來源于植物或者空氣中的某些細菌在蜜露中大量富集，而對蚜蟲天敵產生影響的可能性。Stavrinides 等(2009)證明了豌豆蚜取食被附生細菌侵占的植物時，順帶也攝取到細菌，細菌在其消化系統內寄生和大量繁殖，并通過蚜蟲蜜露排出體外，結果導致接種的葉片上附生細菌的數量急劇上升。

在本次試驗中我們沒有檢測到蚜蟲中普遍存在的內共生菌，這可能是因為昆蟲的內共生菌分離需要更為嚴格的培養要求。此外，在本實驗中為了便于菌落計數和初步了解蜜露中細菌的組成情況，我們僅僅選擇了細菌常用的LB 培養基進行了分析，而不同的培養基和不同的培養條件會分離到更多的細菌種類，這都有待于進一步的深入研究。

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