京冀地區蔬菜葉螨優勢種類鑒定

王少麗，張友軍，吳青君，謝 文，徐寶云

(中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

葉螨屬于蛛形綱蜱螨亞綱真螨目葉螨科，俗稱紅蜘蛛，是農業生產上的重要害螨，為害寄主繁多，包括蔬菜、果樹和棉花Gossypium spp.、小麥Triticum aestivum Linn.等重要農作物，其中在蔬菜寄主中，主要喜食茄子Solanum melongena、菜豆Phaseolus vulgaris、黃瓜Cucumis sativus Linn、番茄Lycopersicon esculentum Mill.、莧菜Amaranthus mangostanus L.、水芹Oenanthe javanica (Blume)和蓮藕Nelumbo nucifera G.等作物。葉螨以成螨和幼若螨聚集在植物葉片背面進行刺吸為害，造成葉片上出現失綠斑點，嚴重時葉片干枯脫落，甚至整株死亡，極大地影響蔬菜的產量和品質。

蔬菜葉螨種類很多，根據以往報道，主要包括截形葉螨Tetranychus truncatus Ehara、朱砂葉螨T.cinnabarinus (Boisduval)、二斑葉螨T.urticae Koch (趙玉偉等，2006;張美淑等，2009;王少麗等，2010)、神澤葉螨T.kanzawai Kishida、土耳其斯坦葉螨T.turkestani (Ugarov et Nikolski)和敦煌葉螨T.dunhuangensis Wang 等。其中截形葉螨、朱砂葉螨和二斑葉螨分布廣泛，它們有時單獨發生，有時混合發生。神澤葉螨也可在茄子、辣椒等蔬菜上為害，但報道較少;而土耳其斯坦葉螨和敦煌葉螨則地域性強，分別在新疆和甘肅等地發生(牙森·沙力等，2007)。由于葉螨體型微小，部分種類非常相似，肉眼識別困難，長期以來很多研究者認為蔬菜上發生危害的紅色葉螨(紅蜘蛛)主要是朱砂葉螨(劉映紅等，1995;吳千紅等，1996;王少麗等，2010;盧永宏和楊群芳，2010)，很多教科書也把朱砂葉螨列為蔬菜作物上的優勢害螨。化學防治仍是目前生產上防治葉螨的主要方式，不同種類葉螨對殺螨(蟲)劑的敏感度存在顯著差異 (van Leeuwen et al.，2010)，據報道，二斑葉螨對殺蟲劑的敏感度比朱砂葉螨或截形葉螨低了4-5 倍，且二斑葉螨具有抗藥性發展基礎的眾多的解毒酶基因 (Grbic et al.，2011)。因此，防治葉螨首先要弄清楚寄主作物上的葉螨優勢種類，然后針對用藥，達到高效防治的目的。

隨著我國各地蔬菜栽培制度的巨大變化，目前蔬菜作物上發生為害的葉螨種類亟需進一步鑒定明確。為了實現對蔬菜作物葉螨的高效防治，作者于2009-2013年采用定點和非定點方法采集了北京和河北局部地區的蔬菜葉螨成螨，室內采用形態學分類及分子生物學鑒定技術進行種類鑒定，研究結果將對進一步明確蔬菜葉螨的種類、葉螨的針對性科學防治及不同種類葉螨的生物學研究等工作奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 葉螨樣品定點采集

葉螨定點采集點為茄子 (品種為“圓雜16號”)田，地點在中國農科院蔬菜花卉研究所位于北京市海淀區的試驗基地。采集田塊為面積為200 m2的塑料大棚。田間進行常規農事管理，未施用任何殺蟲劑。

2009-2013年連續5年分別于6月中旬采集塑料大棚茄子上葉螨樣品，采集方法為:隨機取樣10 株，每株選取中上部葉片上10 頭葉螨，混合為一個樣本。一半活體用于形態學鑒定，剩余部分葉螨保存在70%酒精中，之后存于-20 °C 冰箱中備用。

1.2 葉螨樣本非定點采集

2009-2013年連續5年分別于北京海淀區、昌平區、河北張家口、廊坊等地隨機采集田間不同蔬菜寄主上的葉螨雄性成螨和雌性成螨，特別注意增加雄性葉螨的采集數量，各樣品的采集時間、寄主植物和栽培模式各不相同，采集的葉螨一部分用于形態學鑒定使用，剩余部分樣品放入70%酒精中，保存在-20 °C 冰箱中備用。詳見表1。

1.3 葉螨鑒定方法

1.3.1 形態學鑒定

葉螨樣本在實驗室內進行顯微鏡初判斷，之后將體色為紅色的葉螨樣品進行形態學及分子生物學鑒定。2009年、2010年采集葉螨樣本由日本茨城大學應用昆蟲和動物實驗室的葉螨分類專家Tetsuo Gotoh 教授幫助鑒定，2011-2013年采集的葉螨樣本送交南京農業大學植物保護學院的洪曉月教授的實驗室進行鑒定。每批次標本至少采用10 頭雄成螨、10 頭雌成螨進行，均采用雄性成螨的外生殖器制作玻片，結合雌成螨的體色進行形態學觀察和種類確定，鑒定方法與崔玉楠等(2013)的方法一致。

1.3.2 分子生物學鑒定

采用純凈水對酒精內保存的葉螨樣品沖洗之后，采用北京百泰克生物技術有限公司的DNA 提取試劑盒(溶液型)進行單頭葉螨的DNA 提取，具體方法參照說明書進行。引物設計及種類鑒定的具體方法參照王少麗等(2013)建立的截形葉螨的種類特異性SCAR 分子標記(上游引物Fw:5'-GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'和下游引物Rv:5'-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3')及其擴增程序進行。

2 結果與分析

2.1 葉螨種類鑒定

采集的葉螨種類于室內進行顯微鏡觀察和初步的形態學鑒定后，根據雌成螨的體色，所采集樣本分為兩個體色組:紅色組和黃綠色組(圖1)。黃綠色組葉螨雌成螨為黃綠色，體軀兩側各有一塊黑斑，其外側三裂，內側接近體軀中部呈現橫“山”字形，雄性螨與雌成螨體色相同，體軀末端尖削，因此確定為二斑葉螨(洪曉月等，2012)，僅對紅色體色的葉螨進行雄性外生殖器和分子生物學方法鑒定。對單頭紅色葉螨雄性外生殖器制作切片后顯微鏡下比較，發現其雄性成螨陽莖端錘微小(直徑1.5μm)，端錘背緣平截狀，末端1/3 處有一輕微凹陷，近側突起圓鈍，遠側突起尖利，結合雌成螨的體色，鑒定為截形葉螨(圖2)(洪曉月等，2012)。

圖1 采集葉螨的黃綠色(左)和紅色雌成螨(右)Fig.1 Yellow-green (Left)and red spider mite (Right)female adult collected in this study

圖2 紅色葉螨雄性成蟲的陽具(100×)Fig.2 The aedeagus of male spider mite

同時，采用上述SCAR 分子標記對葉螨試蟲的基因組DNA 進行PCR 擴增，擴增結果見圖3。由圖3 可以看出，所有紅色組葉螨個體均出現一條303 bp的DNA 條帶，而黃綠色個體和清水作為模板的空白對照中未出現明顯條帶，該引物對是截形葉螨的特異性引物對，對葉螨屬的其它種(二斑葉螨、朱砂葉螨、山楂葉螨、柑橘全爪螨及土耳其斯坦葉螨等)的擴增均未出現任何條帶(王少麗等，2013)，由此證明所采集樣品中紅色體色的葉螨均為截形葉螨。

圖3 SCAR 標記引物對葉螨種類的PCR 鑒定Fig.3 PCR identification for the species of spider mite using SCAR primers

2.2 葉螨種類鑒定結果統計

定點調查年份內于每年6月份定點采集葉螨進行鑒定，結果表明，連續5年所采集樣品均為截形葉螨，說明調查地茄子葉螨的優勢種類為截形葉螨(表1)。

非定點調查地點設在北京和河北部分地區(表1)。鑒定結果表明，2009-2011年間采集地點無論茄果類蔬菜或者豆類蔬菜，葉螨優勢種類均為截形葉螨，未見朱砂葉螨、二斑葉螨或者其它葉螨種類。而2012年度除了定點調查中海淀區塑料大棚內仍為截形葉螨外，其它調查點則發生了變化。北京海淀區溫室茄子上為二斑葉螨，同期昌平區露地栽培的茄子田調查初期(5月份)主要為二斑葉螨 (97.14%)，有少量截形葉螨(2.86%)，6月份嚴重為害時期葉螨種類組成相似，以二斑葉螨(96.67%)為主，少量為截形葉螨(3.33%)，而2013年所采集溫室茄子上葉螨全部為二斑葉螨(表2)，說明所調查溫室和露地茄子田中二斑葉螨是優勢種類。

表1 北京和河北部分地區葉螨采集信息及優勢種類鑒定結果Table 1 Sampling information and identification results of spider mites collected in some areas in Beijing and Hebei

3 結論與討論

葉螨是蔬菜作物上的重要害螨，其種類多，田間?；旌习l生。本研究采用形態學鑒定與分子生物學鑒定技術結合，對采集自北京和河北部分地區的蔬菜葉螨進行種類調查與鑒定，結果表明截形葉螨和二斑葉螨是北京和河北部分地區蔬菜作物上的優勢葉螨種類，所采集葉螨樣品中未見到朱砂葉螨或者其它葉螨種類，與以往研究中朱砂葉螨一直位屬常見蔬菜作物優勢種類的觀點(劉映紅等，1995;吳千紅等，1996;盧永宏和楊群芳，2010;王少麗等，2010)不一致。可能存在如下原因:第一，葉螨體型微小，存在變異，形態鑒定非常困難，部分研究者僅根據自己的常規認識或者文獻所述來進行種類判別，可能存在部分的誤判，正如de Mendon?a 等(2011)分析GenBank 中不同葉螨的DNA 序列時，發現葉螨屬的二斑葉螨、朱砂葉螨、神澤葉螨和截形葉螨最易被誤判;而在最近研究中，朱砂葉螨還被稱為二斑葉螨的紅色型(red type)來進行描述(Sun et al.，2012)，進一步說明朱砂葉螨種的界定尚需要進一步研究;第二，由于采集地點的樣本數及采集地域有限，可能以朱砂葉螨為害為主的寄主、地點和發生時期尚未采集到，未來應加大采集區域、寄主植物等進行更多樣本的檢測;第三，葉螨不同種類同域發生，不同種類之間可能存在種間競爭，競爭取代的結果導致了目前的種類分布。研究發現在菜豆寄主上，二斑葉螨比朱砂葉螨的競爭力更強，但在棉花寄主上，朱砂葉螨比二斑葉螨的競爭力更強 (李亞和程立生，2009;2011)。然而，截形葉螨和二斑葉螨、朱砂葉螨彼此之間的競爭力如何尚不明確。但很顯然，不同種類之間競爭力長期發展會導致不同種類之間的演替。

本研究結果表明，即使同在北京市海淀區，采集葉螨的溫室和大棚之間距離約100 m，但是溫室和大棚茄子上的葉螨優勢種類卻不同(分別為二斑葉螨和截形葉螨)，說明栽培模式及其周邊環境可能對葉螨種類存在一定程度的影響。因此，下一步研究中，我們需要在上述栽培模式下，進一步加大蔬菜葉螨種類的采集地點和寄主作物的種類，這樣才可能在更廣泛和代表性意義上明確蔬菜葉螨的主要種類。

不同地點葉螨種類的差異除了與地區、寄主、栽培模式等因素有關外，可能還會受到其它因子的影響。本研究發現2012年度北京昌平區露地茄子田鄰近果園，據分析果園中的二斑葉螨在此地區越冬數量可能相對較多，溫度合適時首先遷入附近的雜草和菜田進行為害，因此茄子田最早發現的零星葉螨僅是二斑葉螨，而后5月份和6月份中都采集到了極少量的截形葉螨，比例約在1.02%-9.04%之間，可能是由附近雜草或者其它作物田中遷入過來。另外，2012年度北京海淀區大棚內的茄子和昌平區露地茄子同是“圓雜16號”品種，但大棚內是截形葉螨，而我們在春季茄子定植初期，發現茄子棚周邊的雜草灰灰菜很多，而灰灰菜上已開始零星發現截形葉螨，因此，推測當茄子苗定植后，截形葉螨很可能是由周邊雜草灰灰菜上的葉螨遷入形成種群。同時，葉螨不同種類之間存在競爭，首先遷入的葉螨占據了生態位之后，可能會使得其它種類的葉螨遷入別處。因此，我們推測葉螨種類的這種分布，很可能與所采集田塊周邊環境中雜草種類和其它作物上發生的葉螨密切關聯，或與首先遷入田間的葉螨種類有關，而日本學者還提出田間葉螨種類還可能隨著天敵、農事操作等因子進行一定程度的變動(Mori et al.，2008;Gotoh and Mori，2011)。

總之，本研究結果表明截形葉螨和二斑葉螨是北京和河北部分地區蔬菜作物上的優勢葉螨種類，而二斑葉螨的耐藥性比截形葉螨更強，因此生產實踐中防治葉螨首先應該明確其優勢種類，在此基礎上進行葉螨的針對性防治。

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