構建轉生長素基因鱘龍魚的研究設想

李亞芹　臧學麗　張春雨

摘要：自1985年朱作言教授率先研制出世界上首例轉基因魚以來，世界上已經有超過35種的魚用于轉基因研究，絕大多數魚類的轉基因研究以培育具有優良生產性狀的新品系為目的。其中，生長激素轉基因魚由于具有生長速度快、餌料轉化效率高等特點而備受關注。中華鱘是我國珍稀水產動物，具有重要的科研價值和生態意義，目前尚未得到足夠的關注，筆者希望利用轉基因技術，獲得具有快速生長的轉基因中華鱘龍魚純合子，篩選出優良轉基因魚新品種。采用顯微注射方法，將帶有黃河鯉MT基因啟動順序與大馬哈魚LGH基因的重組片段導入鱘龍魚受精卵中，通過Northern、Southern雜交方法進行檢測，希望可以促進鱘龍魚的生長。

關鍵詞：轉LGH基因；中華鱘龍魚；生長特性；純合子品種

中圖分類號： S965 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.22.0018

目前在轉基因魚的研究中，轉生長素基因得到了廣泛的認知，它改變魚的代謝特征，轉移基因表達往往對受體魚的代謝產生重要影響。例如，加快受體魚的成長和成熟，提高繁殖速率，減少肌肉脂肪含量，改變事物利用效率以及影響能量收支平衡等[1]。

迄今為止，魚類基因的轉移研究大多使用生長素基因。生長素基因可以在受體魚中整合與表達，表達的生長素基因能夠促進多種受體魚的生長。進一步研究結果顯示，基因表達的生長素基因通過降低代謝能占攝食的比例及提高蛋白質的合成能積累，促進轉生長素基因魚的生長速度，受體魚的肌肉蛋白質含量和事物轉換效率得到顯著提高。顯然，轉生長素基因魚被改變的這些代謝特征，在漁業生產上有重要的應用價值。

鱘魚是我國的名特優珍品，肉味鮮美、骨軟、營養價值高，可以制成高鈣食品及國家級名菜，利用轉基因手段可以挽救這個瀕臨滅絕的珍貴物種，提高該魚的研究價值和經濟價值，具體設想如下。

1 材料方法

1.1 基因材料

受體魚（吉林農大）；大馬哈魚生長素基因LGH（吉林農大）；黃河鯉金屬硫蛋白啟動子MT（吉林農大）。

1.2 試劑與酶

探針標記試劑盒（Promega公司）；dCTP（北京亞輝公司）；酶類（New Biolabs和華美生物工程公司）；其他試劑（全部為分析純）。

1.3 儀器

手動顯微注射器（CellTram 艾本德中國有限公司），注射針（斜面30G注射針常州市雙馬醫療器材有限公司）；顯微鏡（LW300LT 上海測維光電技術有限公司），照相機（5D Mark II佳能株式會社）。

2 實驗方法

2.1 LGH的啟動區刪除，MT啟動子的插入

將LGH用EcoRⅠ酶切，用凝膠電泳回收GH基因；將帶有黃河鯉MT基因啟動順序與大馬哈魚LGH 基因順序重組的環狀基因通過EcoRⅠ酶切，將PGEM312切除，得到6.8Kb的線狀融合基因，即為全魚基因PCMTLGH。

2.2 受精卵采集、基因導入

采集鱘龍魚受精卵，在10月中下旬中華鱘繁殖季節，對健康的親魚進行人工催產，采集精卵5℃條件下存放，每次取適當精、卵進行受精，在受精10分鐘后至第一次卵裂前，將約10微克全魚基因顯微注射到受精卵核附近區。

2.3 魚苗培養

將注射外源基因的受精卵置于20℃水溫箱中，3～4天可孵化出魚苗。待魚苗平游后將其放在網箱中投喂活餌料飼養，長到約2厘米左右放入有防逃措施的魚池中飼養至轉基因魚苗，同時對照魚放在飼養條件相同的另一池塘飼養。第二年春經標記與對照魚放在池塘對照飼養。

2.4 探針制備

將全魚基因用EcoRⅠ酶切，電泳回收6.8左右的DNA條帶。純化后用放射性同位素標記。

2.5 分子雜交

一是DNA檢測。待魚苗成長后，隨機捕獲，剪魚鰭條并做標記，提取DNA，每個DNA樣品均為5微克，將總DNA樣品點樣于硝酸纖維素膜上進行斑點雜交，再將斑點雜交呈陽性的DNA樣品，取10微克經限制性酶切后，轉印到硝酸纖維素膜上，進行Southern印記雜交；二是RNA檢測和Nortnern雜交。

3 預期結果

3.1 轉大馬哈魚LGH外源基因的獲得

將pUcMT與pGEMGH1進行連接、轉化、篩選，獲取轉LGH外源基因pcMTLGH。

3.2 DNA分子雜交

3.2.1 斑點雜交 隨機選取10尾注射過外源基因的中華鱘龍魚進行Southern雜交。

3.2.2 Northern雜交 抽取4尾Southern印跡雜交呈陽性的RNA樣本進行Northern印跡雜交，預期陽性全魚基因整合后25%發生轉錄。

3.3 外源基因在受體魚中的表達

在DNA雜交陽性的魚中，檢測出生長激素基因，表明外源基因在轉基因鱘龍魚中具有合成生長激素的能力。

3.4 轉基因鱘龍魚的預期體重

在生長條件相同的情況下，如果轉LGH基因鱘龍魚的體重是對照魚體重的1.5倍以上，說明外源生長激素基因在鱘龍魚體內穩定表達，具有顯著的促進生長作用；鱘龍魚血清中的生長激素基因濃度可以反映轉LGH外源基因在鱘龍魚中的表達水平。

轉LGH基因技術快速發展的同時也帶來一些需要解決的問題，如受精卵體外操作成活率低，外源基因的整合位點及拷貝數不能控制，表達不能和預期結果相符，外源基因插入容易缺失突變至不育等[2]。只有在認真研究這些問題的基礎上，才能自如地導入目的基因，希望該設想對轉基因鱘龍魚的研究能起到推動作用。

參考文獻

[1] 朱文進，張美俊.動物轉基因技術的研究領域及其對社會的影響[J]動物科學，2005，4：8-10.

[2] 張希春.轉基因魚的食用安全性評價及其分子生物學基礎[J].衛生研究，2004，（02）.

作者簡介：李亞芹，碩士，長春醫學高等專科學校，副教授，研究方向：基因工程。