慢病毒介導(dǎo)Shh基因轉(zhuǎn)染對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響

邊學(xué)海，徐為然，張 廣，張純海，周 樂，李世杰，孫 輝

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)鏡中心）

Sonic hedgehog信號通路涉及到腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移等多個(gè)方面[1－3]。該通路的啟動(dòng)信號Shh蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織中的表達(dá)增高，并與分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Shh可能促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4，5]。已構(gòu)建的pGC－FU－Shh－GFP慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染PTC原代細(xì)胞，并穩(wěn)定過表達(dá)Shh[6]。我們用Shh慢病毒載體轉(zhuǎn)染過表達(dá)Shh基因，觀察對PTC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響，及Sonic hedgehog通路相關(guān)基因表達(dá)變化，試圖為PTC提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用PTC原代細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系提供[7]。慢病毒載體pGC－FU Vector，293T（GENECHEM，上 海），Lipofectamine 2000（Invitrogen），Polybrene病毒感染試劑（Sigma），dNTP（Takara），250bp DNA ladder Marker（捷瑞）。根據(jù)GenBank中人Shh基因序列（NM＿000193.2）采用軟件Primer 3設(shè)計(jì)，Shh基因序列上游引物Shh－F：GGGTTCGGGAAGAGGAGGCA，下游引物 Shh－R：TCGGTCACCCGCAGTTTCA，擴(kuò)增條帶293bp。ShhDNA片段PCR擴(kuò)增和鑒定委托上海GENECHEM公司完成。

1.2 PTC細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分為兩組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達(dá)載體）；陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載體慢病毒陰性對照載體）。轉(zhuǎn)染前1d將生長狀態(tài)良好的PTC細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，隨后按慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟進(jìn)行。取慢病毒轉(zhuǎn)染效率在80%以上的目的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT試驗(yàn) 調(diào)整PTC細(xì)胞密度為1×107個(gè)／L。鋪4個(gè)96孔板，每孔2000個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，取0h、24h、48h、72h后的樣品，每孔加入10μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。在490nm波長處測定吸光度（OD值）。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，繪制兩組細(xì)胞的生長曲線，對比兩組細(xì)胞的生長情況。

1.4 檢測細(xì)胞周期 分別收集Shh－PTC細(xì)胞與陰性對照組細(xì)胞，離心、洗滌重復(fù)2次后加入1ml的4℃預(yù)冷后的70%乙醇固定，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析，得出細(xì)胞周期各時(shí)相的比例。

1.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用孔徑8μm聚碳酸酯膜的Transwell小室，調(diào)整PTC細(xì)胞密度為1×107個(gè)／L。按遷移實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。顯微鏡下取15個(gè)視野，觀察計(jì)算平均數(shù)。

1.6 轉(zhuǎn)染前后Shh通路相關(guān)基因表達(dá)檢測 根據(jù)GenBank中人SMO基因序列（NM＿005631.4），Gli1基因序列（NM＿0001160045.1）及PTCH基因序列（NM＿000264.3）設(shè)計(jì)引物并合成。按 mRNA及蛋白檢測步驟，對PTC細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后SMO、Gli1、PTCH mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有十分顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染PTC細(xì)胞的效率 按轉(zhuǎn)染慢病毒載體與細(xì)胞數(shù)量比值MOI＝20轉(zhuǎn)染人PTC細(xì)胞48h、96h后，分別觀察可見強(qiáng)綠色熒光顆粒，轉(zhuǎn)染效率約為80%，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，表明轉(zhuǎn)染條件穩(wěn)定，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 Shh對PTC細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測細(xì)胞的密度（OD）值繪制細(xì)胞的生長曲線，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組生長曲線陡直，細(xì)胞生長速度較陰性對照組顯著提高（P＜0.05），提示Shh的過表達(dá)有潛在促進(jìn)PTC細(xì)胞增殖的作用。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞不同時(shí)間的生長曲線

流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)：與陰性對照組細(xì)胞相比，Shh－PTC細(xì)胞24h后S期上升至20.88%；Shh－PTC細(xì)胞48h后G1期上升至83.78%，結(jié)果提示：Shh－PTC組G1、S期相對陰性對照組增高，轉(zhuǎn)染Shh基因后的PTC細(xì)胞增殖較快。

2.3 Shh對PTC細(xì)胞遷移的影響 遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目在實(shí)驗(yàn)組15個(gè)視野共511個(gè)細(xì)胞，每個(gè)高倍鏡（400×）視野平均34個(gè)細(xì)胞；陰性對照組15個(gè)視野共323個(gè)細(xì)胞，每個(gè)高倍鏡（400×）視野平均22個(gè)細(xì)胞，見圖2。兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組穿透濾過膜細(xì)胞數(shù)量明顯增加。結(jié)果提示過表達(dá)Shh明顯增強(qiáng)人PTC細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。

2.4 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞Shh mRNA和Shh蛋白的表達(dá)水平

Realtime－PCR檢測細(xì)胞中Shh mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組PTC細(xì)胞Shh mRNA表達(dá)水明顯高于陰性對照組（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達(dá)載體對PTC細(xì)胞的Shh基因過表達(dá)有效。見圖3。

Western blotting檢測實(shí)驗(yàn)組PTC細(xì)胞Shh蛋白的表達(dá)水平明顯高于陰性對照組（P＜0.05），提示慢病毒pGC－FU－Shh－GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PTC細(xì)胞后，Shh蛋白的表達(dá)增多，與Realtime－PCR結(jié)果一致。

圖2 細(xì)胞的遷移活力（400×）

圖3 FQ－PCR（2－△△Ct方法）檢測兩組細(xì)胞Shh mRNA的相對表達(dá)量

2.5 轉(zhuǎn)染后Sonic hedgehog通路相關(guān)的基因SMO、Gli1、PTCH蛋白表達(dá)水平明顯提高。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比過表達(dá)Shh基因的PTC細(xì)胞SMO、Gli1、PTCH 3種蛋白的表達(dá)都有所升高，實(shí)驗(yàn)組SMO表達(dá)是陰性對照的1.154倍，Gli1是陰性對照組的1.062倍，PTCH是陰性對照組的1.205倍。見圖4。

圖4 Sonic hedgehog通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

3 討論

Shh蛋白屬于分泌型信號蛋白，作為Sonic hedgehog信號通路的啟動(dòng)信號，通路過程將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白家族激活下游靶基因，使細(xì)胞發(fā)生一系列病理、生化等方面變化。研究結(jié)果，Sonic hedgehog信號通路途徑的反常在惡性腫瘤的生長和維持中起到重要作用。本研究采用慢病毒載體pGC－FU－Shh－GFP轉(zhuǎn)染PTC細(xì)胞，穩(wěn)定過表達(dá)Shh蛋白，觀察Shh穩(wěn)定過表達(dá)后PTC細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。結(jié)果顯示，Shh穩(wěn)定過表達(dá)后，PTC細(xì)胞表現(xiàn)出了較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力，使細(xì)胞周期G1期上升，提示Shh可能在PTC中參與了其增殖過程。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示過表達(dá)Shh明顯增強(qiáng)人PTC細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力，初步提示Shh可能參與了PTC轉(zhuǎn)移的過程。Shh過表達(dá)后，Sonic hedgehog信號通路中關(guān)鍵基因SMO、Gli1、PTCH mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯提高，驗(yàn)證了PTC細(xì)胞該傳導(dǎo)通路激活過程，符合以往的文獻(xiàn)報(bào)道。目前研究對于信號增強(qiáng)后變異細(xì)胞的鑒別，對于該信號蛋白如何調(diào)節(jié)腫瘤惡性，尤其對Gli蛋白家族的下游靶基因研究較少，也是我們亟待解決的問題。

本研究證實(shí)在PTC的發(fā)生、發(fā)展中Sonic hedgehog通路激活是激發(fā)或促進(jìn)因素，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移。Shh可能為PTC預(yù)后判斷指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn)，尤其可能在進(jìn)展期PTC患者治療中起到作用。推測Shh缺乏膽固醇修飾，可能會(huì)抑制遠(yuǎn)程信號傳遞作用；作用靶點(diǎn)為SMO蛋白的信號通路小分子抑制劑環(huán)王巴明，可能在進(jìn)展期PTC患者治療中起到作用。

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